天作之合：氢气与体外气体交换，一项体外初步研究

摘要

体外循环（ECC）广泛应用于多种治疗方式，如血液透析、心肺转流、体外膜肺氧合（ECMO）等。接受此类治疗的患者常伴有慢性炎症，而炎症本身会伴随氧化应激。然而，ECC 治疗本身也会维持或促进炎症反应。基于此，本研究设计了一项体外实验，旨在探讨氢气（H₂）在 ECC 环境中对促炎因子的治疗潜力。

五个微型 ECMO 回路和一个小瓶（对照组）均用健康成人供体的肝素化血液进行预充（n = 7）。其中三个 ECMO 系统注入脂多糖（LPS），并在其中一个系统中额外加入 H₂ 气体混合物。6 小时后采集样本，评估特定生物标志物（MCP‑1、MPO、MDA‑a、TRX1 和 IL‑6）。

初步结果显示，六个系统之间存在渐进性的氧化和炎症反应。循环本身触发了炎症和血液损伤，但 LPS 对结果的巨大影响无可争议。相应地，氢的修复潜力立即显现，因为在 H₂ 处理的回路中，生物标志物浓度往往更低。未来的研究应明确目标（例如氢给药的剂量/持续时间/周期），以确定患者治疗的最佳方案。

1. 引言

“人工器官”一词指能够部分或完全替代人体器官功能的装置和疗法。通常，这些装置是长期可植入的解决方案，但在其他情况下，它们只能在特定时期或间歇性使用。用于肺、肾和肝脏的装置和治疗属于后一类，需要对血液进行体外处理。上述任一器官功能受损的患者通常还会遭受局部或全身炎症和/或氧化应激，而这些症状往往会因体外治疗而加重 [1,2,3,4]。

近年来，COVID‑19 疫情的爆发使体外膜肺氧合（ECMO）的使用量急剧增加，这使得研究接受治疗患者的氧化/炎症现象变得极为重要 [5,6]。根据 Millar 等人的研究，ECMO 在危重患者中的应用与全身炎症反应相关，这可能导致器官损伤和功能障碍 [7]。这种反应的特征是 ECMO 开始后的前 2 小时内，血浆中炎症细胞因子（如 TNF‑α 和 IL‑8）迅速升高，这可能是由于肠道中预先形成的细胞因子储存被释放 [8]。患者血液暴露于 ECMO 回路的非内皮化表面会进一步加剧炎症反应，从而激活先天免疫系统并可能导致炎症和器官损伤 [3,4,7]。

研究证实，氢气具有抗炎特性，并能在全身炎症模型中提高存活率并减轻器官损伤 [9,10]。这在 ECMO 治疗背景下尤为重要，因为 ECMO 可能导致过度的全身炎症反应 [3,11]。Sano 等人已于 2017 年证明氢气作为急救和重症医学治疗剂的潜力 [12]，而其作为抗氧化剂在血液透析中的应用则始于 2009 年 [13,14]。此外，由于其抗炎和抗氧化能力，氢气已被推荐用于治疗多种全身性疾病 [15,16]。在肺损伤模型中，机械通气（MV）期间补充 2% 氢气可在 2 小时后减少呼吸机诱导的炎症反应并降低上皮细胞凋亡水平 [17,18]。同样，在 ECMO 和 MV 支持下接受氢治疗的大鼠在心脏骤停复苏后 4 小时的存活率比安慰剂组高出 250% [19]。由于 COVID‑19 的出现，氢气作为抗氧化剂和抗炎剂的应用已获得大量关注，因此许多研究推测其对病毒感染副作用的疗效 [15,20,21,22]。

这些发现表明，氢气可能在减轻 ECC 环境中的炎症方面发挥重要作用。为了进一步验证这一论点，本研究设计了一项具有临床相关性的体外实验。重点放在研究氢在气体交换过程中的作用，因为气体交换是继血液透析之后第二常见的体外循环方式 [23]。健康人供体的血液在小型 ECMO 回路中循环，以观察不同参数（回路组件、病原体引入和氢治疗）对炎症反应的影响。本文所传达的初步结果证实了本研究的可行性，并为未来详尽的体外试验铺平了道路。在进行任何体内应用之前，应进一步研究并明确富氢 ECMO 治疗的具体特征。

2. 材料与方法

2.1 供体

由于本研究从一开始就被视为初步研究，并为了尽量减少误差，因此为血液供体的选择设定了一些简单标准：

- 应为健康成人

- 应能够捐献 > 300 mL 血液而无并发症

- 平均血细胞比容 Hct ≥ 42%

- 近期不应有急性发热或其他炎症事件

- 不应有任何血液相关疾病

- 不应使用抗凝药物等

基于上述标准，在本初步阶段排除了女性供体。本研究按照《赫尔辛基宣言》进行，并经 RWTH Aachen 医学院机构伦理委员会批准（EK 23–234，2023 年 7 月 20 日延长批准）。

2.2 体外炎症

根据上述选择标准，捐献的血液在进一步处理之前应无任何炎症和氧化。然而，为了本研究的目的，需要按需人工触发炎症反应。内毒素可促进促炎细胞因子的分泌 [24]，因此被用作解决方案。为了确定最佳剂量，在捐献血液样本中加入滴定浓度的脂多糖（LPS）。6 小时后，使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量每个样本血浆中的白细胞介素 6（IL‑6）浓度。

2.3 实验装置

为了检验所有可能的情况，本研究在体外同时测试了六个系统（5× ECMO，1× 对照），每个系统具有不同的用途。三个回路分别注入 250 ng mL⁻¹ LPS 以人工引发炎症反应，其余回路保持未污染状态。后者用于评估体外循环本身的促炎影响。

为了便于氢气输送（Hydrogen 5.0，Linde AG，慕尼黑，德国），在其中一个 LPS 注入系统上附加了一个气体交换模块。所供应的气体混合物含有大约 6% H₂，导致溶解 H₂ 浓度达到 100–120 ppb。另外两个回路（其中一个也经过 LPS 处理）也配备了相同的气体交换器，以追踪气体交换和此类模块集成所产生的任何影响。当然，这两个系统所接收的气体混合物不含氢，旨在将血气值维持在生理范围内。所使用的气体交换器模块的有效表面积 Aeff 为 0.3 m²，预充体积为 20 mL。

所有五个 ECMO 回路均由蠕动泵（Stoeckert Instrumente GmbH，慕尼黑，德国）、3/16” 和 1/4” 管道以及由薄硅胶制成的可折叠储液器组成。对照组装置由一个装有未处理血液的反应管组成，在整个实验期间保持静置（texp = 6 h）。表 1 总结了每个装置的基本特征及其相应的标记，以避免混淆，而图 1 描绘了主要的装置差异。

表 1. 本研究中测试的系统及其基本特性。带星号的装置额外配备了微型气体交换器模块。

图 1. 本研究中使用的回路组示意图：a. Ref/LPS，b. Ref*/LPS*，c. LPS*H₂。

2.4 测试方案

在获得知情同意并解释研究性质和潜在后果后，从健康男性供体（中位年龄 37 岁，范围 28–55 岁）抽取静脉血（约 300 mL）。肝素钠（B. Braun，梅尔松根，德国）作为抗凝剂直接加入血液容器中（10 IU mL⁻¹）。共进行了七次实验（n = 7）。每次实验中，所有六个系统均使用同一供体的血液进行预充。

预充后，ECMO 回路以 40 mL min⁻¹ 的血流量持续灌注 6 小时。每隔一定时间从每个回路抽取血液样本（200 μL），以测定氧分压（pO₂）、二氧化碳分压（pCO₂）、血红蛋白（Hb）水平以及其他临床相关的血气数据。这一过程由血气分析仪（Radiometer，哥本哈根，丹麦）完成。根据 ISO 7199:2016 [25]，仅调整碱剩余，以防止可能诱发进一步氧化应激和/或血液损伤的酸中毒/碱中毒现象。

为了保留尽可能多的细胞，避免血液稀释（平均血红蛋白 Hb = 14 g dL⁻¹ ± 0.7）。血流量和压降分别通过超声流量计（Transonic，伊萨卡，纽约，美国）和压力计（CODAN pvb Critical Care Inc，福斯廷宁，德国）监测，而气体供应则通过气体流量计（Platon，维也纳，奥地利）调节。如图 1 所示，非接触式氢传感器（Pureron Co. Ltd.，磐城，日本）记录 LPS*H₂ 回路中的溶解氢浓度。

在每次实验结束时，从每个回路采集足够体积（4–5 mL）的血液样本用于多次测量。通过离心（14000× g，5 min，室温）提取血浆，用于通过测量特定生物标志物（双重测量）评估氧化和炎症应激。同样，血浆用于通过分光光度法（Pharmacia Biotech，乌普萨拉，瑞典）测定血液损伤。

6 小时的实验运行时间为蛋白质表达以及氢气与系统中任何活性氧（ROS）反应提供了充足的时间。另一方面，通过遵循血液损伤评估协议[26]，该时长也避免了红细胞完整性受到损害。

为了标准化，特别是由于不同回路之间的预充体积差异显著，本研究采用**标准化溶血指数（Normalized Index of Hemolysis, NIH）来评估血液损伤，如公式（1）所示[27]。

2.5 炎症和氧化应激的生物标志物

由于本研究的范围并不涵盖与氧化和炎症反应相关的全部生物标志物，因此根据相关文献中频繁出现的标志物选择了部分样本进行检测[28,29,30,31,32,33,34,35,36]。一个重要的要求是同时纳入氧化和炎症两类具有代表性的生物标志物，如表 2 所示。生物标志物评估通过 ELISA 进行，并严格按照制造商的操作说明（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）执行。

表 2. 本研究中检测的生物标志物列表。

 2.6 统计学分析

采用多因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，显著性水平设定为 p < 0.05，统计软件为 GraphPad Prism 9.1.1（GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA）。

3 结果

确定体外研究的最佳 LPS 剂量对实验结果的质量和准确性至关重要。在预实验中，血液样本暴露于不同滴定浓度的 LPS 溶液以触发炎症反应。图 2 显示，当 LPS 浓度为 250 ng mL⁻¹ 时，IL‑6 表达达到最大值，因此选择该浓度进行后续实验。

图 2. 基于血液对滴定 LPS 溶液的炎症反应（以 IL‑6 浓度表示）确定实验方案最佳 LPS 剂量的方法。

图 3 展示了每个测试回路的血气参数以及气体交换情况。图 3a 和 3b 分别显示氧分压和氧饱和度，表明气体交换器模块有助于在早期达到稳定状态。相比之下，Ref 和 LPS 回路仅通过管道壁进行被动气体交换，因此达到最终值的时间延迟。同样，如图 3c 所示，Ref*、LPS* 和 LPS*H₂ 回路中的二氧化碳分压迅速达到平衡值，而未通气回路中的二氧化碳则通过管道逐渐散失。图 3d 以循环血液中溶解氢气的浓度形式展示了氢的传递情况。图表显示的是平均值，标准差较小，因此未标注。

图 3. 各回路在实验过程中的气体交换情况：氧分压（a）、氧饱和度（b）、二氧化碳分压（c）和氢浓度（d）。

为了评估不同因素（如回路设计、组件选择和测试方案）对实验过程的影响，本研究测量了溶血率并计算了每个回路的标准化溶血指数（NIH）。此外，该过程还能分别估算机械性溶血和生化性溶血，为理解实验动力学提供了有价值的信息。图 4 显示，在人工触发炎症反应的系统中存在明显的血液损伤，而在经氢气处理的回路中则出现了前所未有的改善。

图 4. 各回路的标准化溶血指数（NIH），作为血液损伤的指标。

图 5 汇总了每个回路中所选生物标志物的表达情况。MCP‑1 在不同装置之间的差异最小，单因素 ANOVA 分析显示其方差不显著（p = 0.2027）。相比之下，MPO 在单因素 ANOVA 中表现出最低的 p 值（1.7024·10⁻¹³），但这主要是由于除对照组外所有回路中 MPO 浓度均显著升高。除平均值外，图表还显示了标准差和显著性水平。TRX1 在各测量值之间的差异较小，但仍具有显著意义（p = 0.0006）。MDA 以及更明显的 IL‑6 最接近各系统中氧化/炎症反应的理想表现，其 p 值分别为 5.5962·10⁻⁹ 和 7.0644·10⁻⁷，均具有高度显著性。

图 5. 每个回路中的生物标志物表达：(a) MCP‑1，(b) MPO，(c) TRX1，(d) MDA，(e) IL‑6。每个图表均显示平均值、标准差和显著性水平（*: p < 0.1，**: p < 0.01，***: p < 0.001，****: p < 0.0001，ns: p > 0.1） 

最后，在整个实验过程中未观察到血浆泄漏，采样也未导致明显的体积损失，这一点可从恒定的压降测量结果得到证实。

 4 讨论

活性氧（ROS）参与并来源于多种细胞病理、疾病和衰老过程[37]。ROS 产生或清除的任何失衡都会引发氧化应激，而氧化应激是炎症反应的前体[38]。氢气已被报道在多种情况和疾病中对氧化应激和炎症具有显著的抑制作用[14,39,40]。本研究之所以探讨氢气在体外气体交换中的作用，是因为 ECMO 治疗常伴随过度的全身炎症反应，而相关研究仍相对缺乏。

本研究从一开始就将人工刺激循环血液中的炎症作为核心步骤。LPS 因其操作简单、易获取且具有可比性，是实现这一目的的理想选择。在进行正式体外实验之前，确定最合适的 LPS 浓度至关重要。通过测量健康人血液样本在不同 LPS 浓度下的炎症反应，发现 250 ng mL⁻¹ 时 IL‑6 表达最高，因此选择该浓度进行后续实验。

如图 3 所示，只有通过可控的气体交换才能维持生理范围内的血气值。尽管未通气回路的 pO₂ 随时间也能超过 100 mmHg，但这些系统中的 pCO₂ 持续下降至远低于动脉值。这种渐进的气体传递被认为与可折叠储液器的材料和壁厚（<1 mm）有关；正是这些赋予储液器柔韧性和可折叠性的特性，使气体能够在循环血液和周围环境之间扩散。此外，尽管 H₂ 处理回路中 pO₂ 随时间保持完全恒定，但血气分析仪（BGA）在分析该回路血液样本时记录的 pO₂ 值却反复低于预期。根据 BGA 的报告，在气体交换器上游采集的气体样本也出现了类似的 pO₂ 降低，这让人怀疑测量存在误差。为了阐明这一问题，在气体交换器入口处安装了在线 pO₂ 气体传感器（FDO2, Pyroscience GmbH, Aachen, Germany）[41]。该传感器记录的值落在预期的 130–140 mmHg 范围内，从而证实了在存在 H₂（无论是在血液中还是在气相中）时 BGA 测量可能存在误差。这一问题需要进一步研究，以确定误差来源，并在进行任何体内试验之前采取必要措施。

如图 3d 所示，尽管氢气不断向环境中散失，但血液中溶解氢的浓度仍保持相对恒定，完全在预期范围内。事实上，由于氢分子体积极小，它能通过大多数材料迅速逸散，因此必须持续供应气体。本研究设定的目标浓度 100–120 ppb 是目前相关研究中最常用浓度的平均值[14]。此外，仅在供应 H₂ 的回路上安装的氢监测水系统（HWMS）始终给出一致的结果，其准确性已通过大量试验和传感器校准得到验证[41]。

图 4 强调了血液损伤是进行气体交换研究时必须考虑的关键参数。考虑到回路规模较小且实验时间较长，未受污染（无 LPS）系统中的溶血程度与类似研究相比并不异常[42]。体外试验中缺乏生理调节机制，再加上血液体积小、实验时间长，可能是 LPS 注入回路中血液损伤显著增加的主要原因。然而，记录的溶血率并未影响血液的气体交换能力，这一点在相关图表（图 3）中可以看出。最后，氢气存在时血液损伤显著减少是一个值得深入分析的有趣现象。

图 5 提供了氢气抗氧化和抗炎作用的证据，其中记录了每个系统中各生物标志物的表达情况。具体来说：

• **MCP‑1**：在所有回路中几乎保持不变。这可能是由于健康供体血液中的细胞数量较少，使得 MCP‑1 表达的变化难以被观察到。LPS 系统中 MCP‑1 浓度的轻微升高也证实了被激活的细胞数量较少。

• MPO：大多数回路的 MPO 浓度都趋向于对照组。对照组与 Ref/LPS 系统之间的差异较小，使得氢气的作用空间有限，这与 MCP‑1 的情况类似。不同装置之间的轻微差异表明细胞激活具有时间依赖性，而非剪切率诱导的应激。尽管如此，这些发现可能为体内研究提供线索，因为体内环境中细胞会随时间发生变化，且存在体内激活机制，这可能有助于更好地评估氢气的疗效。

• TRX1：TRX1 的表达似乎不受氢气影响，这与 MPO 的情况不同。这与 TRX1 和 MPO 分别与抗炎和促炎活性相关的事实相符。因此，MPO 浓度降低对应于 TRX1 浓度升高。

•MDA：不同系统中 MDA 的表达水平存在差异，表明存在时间相关和机械应力相关的综合作用。LPS 引起的炎症反应再次被氢气处理所抑制，尽管未恢复到基线水平。这与 Huang 等人的研究结果一致，他们发现氢气处理的肺组织中 MDA 浓度低于氮气处理的肺组织[17,18]。

• IL‑6：氢气对 IL‑6 表现出明显的抑制作用。与 MDA 不同，IL‑6 被显著抑制，这为氢气的抗炎作用及其所抑制的特定通路提供了有力证据，这与已有报道一致[43]。此外，与 MPO 一样，IL‑6 也具有促炎特性，由于其被显著抑制，抗炎活性可能自然增强（例如 TRX1 升高）。

最后，尽管通气回路和“未通气”回路之间的血气数据存在差异，但在姐妹系统（如 Ref–Ref*）中未观察到生物标志物表达的偏离。

上述部分发现提出了血细胞数量的问题，而血细胞数量直接关系到回路的总血容量。自从决定使用人类血液进行研究以来，这一直是一个障碍，因为这需要大幅缩小所有组件的尺寸。出于同样的原因，本研究未纳入 Ref*H₂ 回路，特别是因为一些初步测量表明氢气不会与健康血液发生明显反应。未来或许可以利用医院血库的储备血液（用于质量控制目的）来解决血液供应不足的问题。然而，血袋通常含有枸橼酸磷酸盐葡萄糖（CPD）作为抗凝剂，这与本研究使用肝素作为抗凝剂的设计不符，因为本研究旨在使结果尽可能接近临床实际。

总体而言，本研究的实验结果非常积极，证实了氢气在 ECMO 环境中的预防作用和治疗潜力，并为未来的研究和后续医学应用奠定了基础。后续研究可以通过探索以下参数提供更有价值的信息：

• 血容量对生物标志物表达的影响  

• 更广泛的生物标志物谱  

• 氢气浓度对其治疗效果的影响  

• 不同给药模式（如持续、间歇或延迟给药）下氢气的抗氧化和抗炎作用  

此外，招募更多供体（包括男女以及特定患者群体）将使研究更具说服力。

未来研究还应考虑氢气治疗潜力的双重性。有趣的是，以硫化氢（H₂S）形式存在的氢已被证明对免疫细胞有显著影响，它可以调节巨噬细胞的炎症反应，可能减轻促炎表型[44]。然而，持续暴露于高浓度 H₂S 会导致免疫抑制，引发氧化应激、炎症、凋亡以及 T 辅助细胞失衡[45]。另一方面，氢气已被发现是一种保护剂，可减轻辐射诱导的免疫功能障碍，降低氧化应激和凋亡，并调节 T 细胞平衡[46,47]。此外，超生理水平的过氧化氢（最常见的 ROS 之一）会引发血管收缩、内皮功能障碍、高血压和促炎状态[48]。因此，过氧化氢可能在 ECMO 治疗期间促进炎症反应。氢气给药的结果有时相互矛盾，且可能依赖于载体化合物的组成，这需要进一步研究以充分理解 H₂ 对细胞功能的影响，而这在许多情况下只能通过长期体内模型来解决。

5. 结论

本研究试图确定氢气在体外气体交换环境中的治疗潜力。为实现这一目标，本研究组装了多个 ECMO 回路，并使用健康人供体的肝素化全血进行体外测试。研究结果显示，在注入 LPS 的回路中血液损伤明显升高，而气体交换和维持生理水平的血气平衡似乎对炎症结果没有特别影响。相反，正如多种生物标志物所显示的那样，氢气在对抗氧化应激和炎症应激方面表现出特别显著的能力，同时在减轻溶血方面也具有改善作用。