内源性氢气是肠道菌保肝的基础【哈佛经典】

众所周知，一些肠道细菌，如大肠杆菌，能够产生大量的氢气(H2)。尽管氢气的抗氧化作用有据可查，但目前的研究检验了从肠道细菌释放的氢气是否会影响Concanavalin A (ConA)诱导的小鼠肝炎。全身性抗生素显著降低了肝脏和肠道中氢气的水平，并抑制了肠道细菌。通过血清中AST、ALT、TNF-α和IFN-γ水平的测定，抗生素抑制肠道菌群增加了ConA诱导的肝炎严重程度，而用产氢气的大肠杆菌重构肠道菌群，而不是缺乏氢气的突变型大肠杆菌，则下调了ConA诱导的肝脏炎症。此外，体外实验表明，通过引入氢气显著抑制了ConA刺激的脾淋巴细胞产生的TNF-α和IFN-γ。这些结果表明，从肠道细菌释放的氢气可以抑制ConA在肝脏中诱导的炎症。

Kajiya M, Sato K, Silva MJ, Ouhara K, Do PM, Shanmugam KT, Kawai T. Hydrogen from intestinal bacteria is protective for Concanavalin A-induced hepatitis. Biochem Biophys Res Commun. 2009 Aug 21;386(2):316-21.

引言

氢气(H2)溶解在水中对缺血再灌注引起的脑损伤小鼠模型中的抗氧化效果已被证实[1]。继这项研究之后，其他几篇报告也表明，氢气能抑制由氧化应激在器官中（如肝脏、肠道和心脏）引起的组织损伤[2]，[3]，[4]。由于炎症与氧化应激之间的密切联系被广泛认可，它们相互激活，因此有效的抗氧化剂也应该能抑制在组织破坏性疾病中诱导的炎症。然而，很少有报告记录氢气的抗炎作用。

重要的是，在过去的动物模型研究中，氢气以气体形式外源性应用或溶解在水中供给动物[1]，[2]，[3]，[4]。然而，确实有些肠道细菌，如大肠杆菌(E. coli)，由于拥有氢化酶能够产生氢气[5]。如果肠道细菌确实释放了氢气[6]，那么这种内部产生的氢气应该影响宿主对氧化以及炎症应激的抵抗力。然而，迄今为止还没有研究涉及由肠道细菌产生的氢气对宿主抵抗炎症刺激的影响。

刀豆蛋白A (ConA) 是一种凝集血红细胞的血凝素，并且主要是刺激T细胞的有丝分裂原。因此，它通过活化淋巴细胞的浸润导致急性炎症，这导致了肝细胞的大量坏死性组织损伤，伴随着肝窦内止血[7]，[8]。因此，ConA诱导的肝炎已被用作实验性鼠模型，反映了人类自身免疫性肝炎的大部分病理特性[9]。无胸腺裸鼠和SCID鼠对ConA诱导的肝炎的抵抗力清楚地表明了T细胞在ConA诱导的肝损伤中的允许作用[10]，[11]。尽管ConA引起的组织损伤限于肝脏[11]，但解释这种器官特异性的潜在机制仍然不清楚。尽管如此，ConA介导的T细胞活化也会增加血液中促炎细胞因子的水平，包括肿瘤坏死因子α (TNF-α) 和干扰素γ (IFN-γ)，这些细胞因子由活化的T细胞释放，并被认为在ConA诱导的肝脏炎症发展中扮演关键角色[12]，[13]，[14]。

使用Concanavalin A诱导的急性肝炎小鼠模型，本研究检查了(1)从肠道定植的细菌释放的氢气的数量，以及(2)从肠道细菌释放的氢气对肝脏炎症的影响。

材料与方法

动物

8至10周龄的雄性C57BL/6j小鼠被饲养在常规环境中，光照周期为12小时，温度恒定。本研究使用的实验程序已获得Forsyth IACUC的批准。

建立表达GFP的大肠杆菌

本研究使用了大肠杆菌W3110菌株（ATCC 27325）及其不产生氢气的hypF缺失突变菌株PMD23（补充材料1；可在线获取）。HypF是合成活性氢化酶不可或缺的，因为其缺失会导致氢化酶活性降低超过95% [15]，[16]。通过电穿孔法，两种大肠杆菌菌株都被转染了含有氨苄西林抗性基因（Ampr）启动子的pGFPuv-载体（Clontech, Mountain View, CA）。得到的两个菌株，即大肠杆菌W3110gfp+（Ampr+/GFP+/HypF+）和大肠杆菌PMD23gfp+（Ampr+/GFP+/HypF−），在含有氨苄西林（100 μg/ml）的Luria–Bertani（LB）肉汤中培养。

氢气的测量

使用针型氢传感器（Unisense A/S, Aarhus, Denmark）按照Hayashida等人[3]发表的方法测量小鼠器官中产生的氢气（H2）。在小鼠吸入CO2后立即处死，将针型氢传感器放置到由25-G针头准备的器官路径中。或者，直接将氢传感器放入通过心脏穿刺取得的血液样本中。通过在水中饱和氢气气体（25°C时为781μM或37°C时为721μM）在大气压力下制备氢气的标准正浓度，而未处理的对照水用于0μM 氢气量的制备。氢气的扩散系数始终被考虑并调整（例如，从塑料管中取样的血液中为0.7μM/min）。

溶解水产生氢气

将高纯度氢气气体（Airgas, Salem, NH）注入水或培养基中，直到氢气浓度达到饱和（780μM，25°C）。然后，通过稀释制备适当浓度的氢气。水中饱和的氢气显示出pH 7.6和非常高的氧化还原电位（ORP水平-511 mV）。

刀豆蛋白A诱导的急性肝炎模型

实验方案-A：（1）动物供应含有抗生素混合物（磺胺甲恶唑，8 mg/ml，和甲氧苄啶，1.6 mg/ml）的水或对照无抗生素水自由饮用3天。（2）接下来的两天，两组动物都自由饮用无抗生素水。（3）向两组小鼠静脉注射ConA（Sigma, St. Louis, MO, 15 mg/kg；生理盐水溶液），并在注射后0、2和10小时监测血清中的ALT和AST。

实验方案-B：（1）动物供应含有抗生素混合物（磺胺甲恶唑，4 mg/ml；甲氧苄啶，0.8 mg/ml；和氨苄西林，0.1 mg/ml）的水自由饮用3天。（2）接下来的三天，动物继续自由饮用含有氨苄西林（0.1 mg/ml）的水。（3）向两组小鼠注射ConA（15 mg/kg，生理盐水溶液）：（a）那些在ConA注射前12小时以及注射后0和3小时接受富含氢气的水（780μM，pH 7.6，每只鼠1 ml [经口]，n = 5/组）或（b）那些接受对照水（每只鼠1 ml [经口]，n = 5/组）。ConA注射后，两组仍然供应含有氨苄西林的水。实验方案-B的图示显示在图2A中。

图1. 系统性抗生素治疗对肠道和肝脏中氢气水平以及小鼠对ConA诱导的肝炎的敏感性的影响。（A）使用针型氢传感器测量的不同器官中的氢气浓度显示在直方图中（每组n=3）。（B）从用抗生素处理或未处理的小鼠收集的新鲜粪便样本（粪便，20 mg/10 ml LB肉汤，每组n=3），在37°C下孵育1小时或12小时，然后测量细菌培养中的氢气。（C和D）将ConA（15 mg/kg）静脉注射到预处理有无抗生素（磺胺甲恶唑，8 mg/ml，和甲氧苄啶，1.6 mg/ml）的小鼠体内，这些小鼠已经用抗生素水处理了3天，然后是2天的无抗生素水休息期。测量血清中的ALT（C）和AST（D）水平。数据以每组五只小鼠的平均值±标准差表示。*p<0.05，**p<0.01：值具有显著差异（t检验）。

图2. 外源性应用氢气对经抗生素预处理的C57BL/6j小鼠ConA诱导的肝损伤的影响。（A）实验方案B的图解：详细内容见材料与方法部分。在ConA注射后0、2和6小时收集的小鼠的ALT（C）、AST（D）、TNF-α（E）和IFN-γ（F）水平被测量，并在直方图中展示。每个直方图（C、D、E和F）中的柱状和条形表示各值的平均值±标准差（每组n=5）。*p<0.05，**p<0.01：值具有显著差异（t检验）。

实验方案C：（1）动物供应含有与方案B中相同的三种抗生素混合物的水自由饮用3天。（2）接下来的三天，动物继续自由饮用含有氨苄西林（1 mg/ml）的水。（3）向两组小鼠注射ConA（15 mg/kg，生理盐水溶液）：（a）那些用E. coli W3110gfp+重构的（每组n=5）或（b）那些用PMD23gfp+定植的（每组n=5）。这两种E. coli菌株在中期对数生长阶段被收获并应用（10^9细菌/100 μl含5%羧甲基纤维素的生理盐水/鼠 [经口]），使用Popper喂食针在ConA注射前2天进行。即使在ConA注射后，两组仍然供应含有氨苄西林的饮用水。实验方案C的图解显示在图3A中。

图3. 用产氢气的大肠杆菌重构肠道，而不是缺乏氢气的大肠杆菌，能够下调经抗生素预处理的C57BL/6小鼠中ConA诱导的肝损伤。（A）实验方案C：详细内容见材料与方法部分。（B）在含有氨苄西林（100 μg/ml）的LB肉汤中培养12小时，由大肠杆菌菌株PMD23（Ampr+/GFP+/HypF−）或W3110（Ampr+/GFP+/HypF+）产生的氢气水平。在ConA注射后0、2和6小时收集的小鼠的ALT（B）、AST（C）、TNF-α（D）和IFN-γ（E）水平被测量，并在直方图中以平均值±标准差的形式显示（每组n=5）。∗p<0.05，∗∗p<0.01：通过t检验显著不同。

肝脏炎症生物标志物和促炎细胞因子的测量

通过确定血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平来分析肝损伤的程度，使用检测试剂盒并按照制造商的说明进行（Biotron Diagnostics, Hemet, CA）。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（PeproTech, Rocky Hill, NJ）进行促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ的定量。

肝脏组织病理学分析

从ConA注射后10小时牺牲的小鼠取样的肝脏左叶进行组织学分析，通过苏木精和伊红（H&E）染色。

脾淋巴细胞增殖及其产生促炎细胞因子的体外分析

使用Histopaque（Sigma）通过密度梯度离心从C57BL/6j小鼠的脾脏中分离单个核淋巴细胞。在96孔板中，将淋巴细胞（2×10^5/孔）用含有10% FBS、l-谷氨酰胺和抗生素的RPMI培养基预处理，其中溶解有氢气（浓度为175、350和700 μM）。然后在96孔板中的细胞与ConA（1 μg/ml）反应24小时，有无ConA的情况下，将培养上清液用于ELISA检测TNF-α和IFN-γ。在96孔板中的脾淋巴细胞进一步与[3H]胸苷（0.5 μCi）共孵育48小时培养的总时间的最后16小时，并通过放射性闪烁计数器监测处于增殖状态的细胞中的放射性（cpm）。

结果

在动物的肠道中，氢气作为碳水化合物发酵的副产品而产生[17]。研究还表明，活体小鼠胃或肝脏中的氢气浓度（约20-80 μM）比氢气的整体细胞Km值高出20倍以上[6]，[18]。基于这些证据，我们假设腹部器官中如此高水平的氢气来自肠道细菌。为了验证这一假设，小鼠在3天内用抗生素（磺胺甲恶唑和甲氧苄啶）处理，然后是2天的无抗生素水休息期。之后，通过在红细胞琼脂平板上培养新鲜粪便来确认抗生素抑制肠道菌群的效果（对照未处理的小鼠，1.6 ± 0.5 × Log10^9 CFU/g；抗生素处理的小鼠，7.0 ± 6.1 × Log10^7 CFU/g）。图1A显示了不同器官中的氢气量。盲肠中检测到的氢气量最高，其次是小肠、大肠、肝脏、脾脏和血液。在大脑中检测到微量的氢气。系统性地用抗生素（磺胺甲恶唑和甲氧苄啶）治疗小鼠显著降低了所有测试器官中的氢气检测量。从用抗生素处理的小鼠取样的新鲜粪便的体外培养也显示，与对照未处理的小鼠收集的样本相比，氢气的产生显著降低（图1B）。这些数据显示了抗生素依赖性的氢气变化，如在小鼠器官的原位测量和体外粪便培养所示，并表明肠道管道以及肝脏和脾脏中的氢气直接来源于常驻细菌。

为了探索在肠道管道中产生氢气的共生细菌是否存在会影响小鼠对ConA诱导的肝损伤的敏感性，将ConA（15 mg/kg）静脉注射到用抗生素预处理或未处理的小鼠体内（实验方案-A）。ALT和AST的基线水平在用抗生素预处理与未处理的小鼠组之间没有差异（图1C和D），表明抗生素并未造成肝损伤。在2小时测量的血清中ALT和AST水平在接受抗生素治疗的小鼠中显著升高，但与0小时测量的对照基线水平无差异（图1C和D）。肝脏的组织形态学分析也表明，与对照未处理的小鼠相比，接受抗生素治疗的小鼠的组织损伤程度更严重（见补充数据1），这表明抗生素治疗增加了小鼠对ConA诱导的肝炎的敏感性。换句话说，没有抗生素时，肠道菌群的存在似乎足以防止ConA诱导的肝炎的发展。

如果由肠道细菌产生的氢气负责保护肝脏免受ConA诱导的炎症，那么外源性补充抗生素处理过的小鼠的氢气应该能够降低抗生素处理过的小鼠对ConA挑战的炎症反应水平。为了验证这一假设，抗生素处理过的小鼠通过口服方式接受了溶解有氢气的水（实验方案-B）。正如预期的那样，通过口服途径外源应用的氢气显著抑制了抗生素处理过的小鼠在ConA注射后6小时测量的炎症标志物ALT和AST（图2B和C）。重要的是，由激活的T细胞产生的促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ，在抗生素处理过的小鼠中外源应用氢气后也被显著下调（图2D和E）。

为了检验来自肠道细菌的氢气对ConA诱导的肝损伤的影响，用抗生素预处理的小鼠通过两种不同的大肠杆菌菌株进行了重构，即（1）产氢气的大肠杆菌菌株W3110gfp+或（2）缺乏氢气的大肠杆菌菌株PMD23gfp+；然后，将ConA静脉注射（图3A，实验方案-C；图3B，W3110gfp+和PMD23gfp+的氢气产量）。在接受含有氨苄西林的饮用水的小鼠中，通过在含有氨苄西林的琼脂平板上培养小鼠粪便中回收的GFP+细菌，确认了这两种大肠杆菌菌株的定植。在被W3110gfp+菌株定植的小鼠的 small intestine、large intestine、cecum 和 liver 中检测到了较高水平的氢气，而被PMD23gfp+菌株定植的小鼠在这些器官中保持了低水平的氢气（见补充数据2）。与携带PMD23gfp+的或对照小鼠相比，ConA注射后6小时收集的血清中ALT和AST水平在W3110菌株小鼠中显著降低（图3C和D）。血清中TNF-α和IFN-γ的水平在携带W3110gfp+的小鼠中也显著低于携带PMD23gfp+的或对照小鼠（图3E和F）。因此，基于实验方案-A、-B和-C的结果，来自肠道细菌释放的氢气似乎在抑制ConA注射诱导的肝脏炎症中发挥了作用。

人们认为，来自激活的T细胞释放的TNF-α和IFN-γ会导致ConA诱导的肝炎模型中的肝组织损伤[12][13][14]。因此，为了解决氢气是否可以影响ConA刺激的T细胞中TNF-α和IFN-γ的产生，体外用ConA刺激脾脏单个核淋巴细胞（MNL），并在氢气存在或不存在的情况下进行。如图4所示，与在没有氢气的情况下用ConA刺激MNL相比，培养基中氢气的存在显著抑制了MNL的增殖（图4A），以及TNF-α和IFN-γ的产生（分别为图4B和C）。值得注意的是，氢气本身既不影响非刺激MNL的增殖，也不影响IFN-γ的产生。因此，这项体外研究强烈支持了氢气可以抑制ConA介导的T细胞激活，从而导致组织破坏性TNF-α和IFN-γ的产生的前提。

图4. 氢气对ConA刺激的淋巴细胞炎症反应的体外效应。从C57BL/6小鼠脾脏中分离出的单个核淋巴细胞，在96孔板中用溶解有氢气的介质预处理，浓度分别为175、350和700μM，处理1小时。然后，细胞在有无ConA（1μg/ml）的情况下反应24小时，以通过ELISA测量促炎细胞因子的表达，或反应48小时，通过[3H]胸苷掺入实验评估增殖情况。淋巴细胞的增殖（A）以及培养上清液中TNF-α和IFN-γ的产生（B和C）在直方图中显示。SI（刺激指数）：受刺激细胞的cpm与未受刺激细胞的cpm之比。柱状图和条形图表示三个不同培养的相应值的平均值±标准差。∗p < 0.05, ∗∗p < 0.01：值显著不同（t检验）。

讨论

积累的证据表明，肠道常驻细菌在它们与宿主共生的关系中具有保护宿主的功能[19][20]。然而，支持这种细菌介导的宿主保护功能的潜在机制尚不清楚。一些研究揭示，与常规小鼠相比，无菌小鼠的肠道血液系统的血管化程度较差，这表明肠道共生细菌可以影响宿主稳态血管生成的发育[21]。然而，既然来自肠道常驻细菌产生的氢气已被证明对Concanavalin A诱导的小鼠肝炎具有抗炎作用，本研究展示了由肠道定植细菌介导的一种新颖的抗炎机制。如果氢气确实像我们在实验方案A、B和C中所证明的那样，在ConA注射诱导的肝脏炎症中发挥抑制作用，那么由共生细菌促进的微血管网络通过血流运输氢气是合理的。

值得注意的是，一般认为口服补充氢气的抗炎效果高于肠道细菌释放的氢气。但通常情况下情况正好相反，因为氢气不断地从存在于肠道消化内容物中的细菌（约1克/鼠）释放出来，而总的水消耗量约为每天2毫升/鼠，并且所有来自饮用水的氢气都会立即从胃部扩散出去。因此，我们研究中肠道细菌释放的氢气的相对较低的抗炎潜力最合理的解释可能是，氢气被存在于肠道粘膜深处或胃中的其他细菌清除，例如报道说会消耗大量氢气的Helicobacter hepaticus[6]。为了证实这一假设，需要对口腔胃肠道粘膜中产生或消耗氢气的细菌进行详细分析。

尽管大多数之前的研究检查氢气的生物效应都集中在由器官（如肝脏和大脑）的缺血再灌注引起的氧化性组织损伤上[1][2][3][4]，但尚不清楚氢气是否也能影响淋巴细胞激活所引发的炎症。因此，这项研究的新颖之处在于发现了来自共生细菌产生的氢气（H2）似乎能够抑制ConA刺激的淋巴细胞产生破坏组织的促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ。此外，活性氧（ROS）可以通过上调NF-kB信号通路来激活TNF-α表达[22]，同时，它也可以激活NADPH-氧化酶（NOX）表达，从而从NADPH产生ROS[23]。因此，炎症和氧化过程是相互关联的。ROS和炎症之间这种多重交叉反应表明，氢气介导的对ConA刺激的淋巴细胞中TNF-α和IFN-γ的抑制也可能涉及氢气的抗氧化效果。

总之，本研究表明，从肠道定植细菌释放的氢气可以抑制Concanavalin A在肝脏中诱导的炎症，全身抗生素治疗可能会改变肠道中保护宿主的共生细菌群落的数量，最终导致肝脏中存在的氢气浓度降低，影响氢气的抗炎症作用。由于大多数哺乳动物缺乏产生氢气的分解酶，肠道细菌是肝脏中保护性氢气的唯一可能来源。实际上，共生细菌在宿主防御中的作用之一可能取决于常驻菌群产生抗炎性氢气的能力。因此，外源性因素，如抗生素的引入，可能会影响氢气的功能量，从而影响机体对疾病的易感性。

补充数据

补充数据，在对小鼠肝脏进行组织学评估时，我们比较了三组不同的小鼠肝脏样本：

- (A) 未接受抗生素处理的正常小鼠。

- (B) 在接受Con A注射10小时后的抗生素处理小鼠。

- (E) 在接受Con A注射10小时后的对照非处理小鼠。

这些肝脏样本被切片并且用苏木精-伊红(HE)染色，放大倍数为200倍。

另外一组补充数据显示了重构大肠杆菌菌株对不同器官中氢气浓度的影响。经过抗生素预处理的小鼠通过两种不同的大肠杆菌菌株进行了重构，即：

- (1) 产氢的大肠杆菌菌株W3110gfp+。

- (2) 缺氢的大肠杆菌菌株PMD23gfp+（实验方案C）。

在不同器官中的氢气浓度是在Day-1使用针型氢传感器测量的（每组n = 3）。星号标记*p < 0.05表示用括号标记的列之间的值有显著差异（t检验）。

Bacterial strains.  A wild type Escherichia coli strain W3110 (ATCC 27325) and a hypF deletion derivative, strain PMD23, that is defective in all three hydrogenase activities of the bacterium were used in this study. Strain PMD23 was constructed using the methods described by Datsenko and Wanner (1). For construction of strain PMD23, two PCR primers that also contain 50 bases long hypF DNA flanking the ends of the region to be deleted were used to amplify a kanamycin resistance gene cassette in plasmid pKD4 (ATGGCAAAAAACACATC TTGCGGT GTCCAAC TGCGTATTCGTGGCAAAGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC and CACCCGCCGGTAAACTCTGTGGAAAGAGCAATGTGAAATCAGCGAGATAACATATGAATATCCTCCTTAGT; underlined, hypF sequence). The resulting PCR product was introduced into E. coli strain BW25113 (1) by electroporation and kanamycin-resistant transformants were selected on rich medium with kanamycin (50 mg/L) and tested for fermentative H2 production (2). All kanamycin-resistant transformants tested were defective for H2 production. Using phage P1 (3) the ΔhypF-FRT-kanR-FRT mutation was transduced to wild type E. coli strain W3110 (strain PMD22). The kanamycin gene cassette in strain PMD22 was removed as described by Datsenko and Wanner (1) that left one FRT sequence at the site of deletion. The resulting kanamycin-sensitive strain, PMD23 carries a deletion of 2088 bp of the 2253 bp long hypF gene.

References

1. Datsenko, K. A., and B. L. Wanner. 2000. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97:6640-6645.

2. Lee, J. H., P. Patel, P. Sankar, and K. T. Shanmugam. 1985. Isolation and characterization of mutant strains of Escherichia coli altered in H2 metabolism. J. Bacteriol. 162:344-352.

3. Miller, J. H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY.