如何冷冻保存活组织、器官甚至整个生物体，然后使它们起死回生

明尼苏达大学（University of Minnesota）的移植外科医生约瑟夫·苏希尔·拉奥（Joseph Sushil Rao）面前手术台上的大鼠肾看起来像是经历了地狱。它有一个非常冷的经历。

How to deep freeze an entire organ—and bring it back to life | Science | AAAS

通常是一个深粉红色，这个拇指大小的器官被焯成尸体般的灰色。在过去的6个小时里，它被从一只白色实验室老鼠的腹部取出，注满黑色液体，卡在冷却至零下150°C的冰箱中，并被强大的磁铁处理。

现在，在明尼苏达大学（UMN）马尔科姆·穆斯健康科学塔（Malcolm Moos Health Sciences Tower）11楼一个狭窄、没有窗户的房间里，Rao从一个小塑料盒中取出肾脏，轻轻地把它放在另一只白鼠敞开的腹部里。通过显微镜观察，移植外科医生使用人类头发厚度一半的线巧妙地将肾脏的动脉和静脉拼接到大鼠的腹部血管中。

当他终于取下夹住主动脉血液供应的微小夹子时，肾脏表面变红了，这是一个好的第一个迹象。然后他等待着。45分钟后，一滴金色尿液从输尿管中流出，通常从肾脏输送到膀胱。

就在午夜之前，Rao用他的iPhone拍了一张特写照片，证明肾脏正在工作。他将这张照片和一封欣喜若狂的电子邮件发送给了他的两位老板，移植外科医生埃里克·芬格（Erik Finger）和生物医学工程师约翰·比肖夫（John Bischof），标题为“首次成功移植玻璃化纳米温热的大鼠肾脏”。

“我无言以对，”他写道。“这对我们所有人来说都是一个值得骄傲的时刻。这并不容易。但是，它得到了回报。

2022 年 4 月的那一刻是最近在寻求有效停止生物时间方面的一系列突破之一。经过数十年的挫折和停滞不前的进展，科学家们终于在过去10年中取得了重大进展，利用极端寒冷来减缓甚至阻止所有生物通常腐烂的命运。他们开发了新的方法来降低化学防冻处理的毒性，最大限度地减少破坏性冰晶的形成，并快速均匀地解冻物体。自2018年以来，实验室已经冷冻并恢复了珊瑚，果蝇幼虫，斑马鱼胚胎和大鼠肾脏。他们还采用了更温和的技术，将从西红柿到整个猪肝的所有东西冷却到冰点以下，而不会结冰，使它们可以数天或数周保持新鲜。

医疗用途，特别是器官移植，是当今工作的关键驱动力。科学家们希望最终能够创造出冷冻保存的组织库，如皮肤、整个器官甚至四肢，缓解器官短缺，让医生有时间更好地为移植对象做好准备。但保存方面的进步也延伸到用于筛选药物的人体组织斑点、濒临灭绝的物种、遗传学家研究的果蝇、运往杂货店的农产品以及储存用于水产养殖的鱼胚胎。Mehmet Toner是马萨诸塞州总医院（MGH）的生物工程师，也是冷冻保存领域的领导者之一，他将按需储存的活组织的愿景比作更熟悉的聚宝盆。“我称之为，”他说，“生物存储的亚马逊。”

明尼苏达大学（University of Minnesota）的移植外科医生约瑟夫·苏希尔·拉奥（Joseph Sushil Rao）准备在器官在极低的温度下保存之前，从实验室大鼠身上取出肾脏（第一张图片）。复杂的肾脏管道需要Rao在移植的所有阶段进行精细处理（第二张图）。

在好莱坞电影中长大的人可能会认为冷冻和复活整个生物体的技术指日可待。星球大战的汉·索罗被困在“碳酸盐”中并复苏。汤姆克鲁斯在《少数派报告》中在反乌托邦监狱中变成了人类冰棍。美国队长在漫威电影中被埋葬在北极冰层中，并在近 70 年后重新加热以制作续集。

现实远没有那么简单。通常在远低于零度的温度下储存并复活的最大生物是一粒食盐的大小：人类胚胎。尝试使用当今技术对整个人进行尝试，结果将是一个充满有毒化学物质的死气沉沉的身体，冷冻学家Greg Fahy说。“你会很遗憾的。”

Fahy是一对科学家之一，他们1985年在《自然》杂志上的论文揭示了一种化学过程，允许小鼠胚胎储存在近-200°C的温度下。 他们的技术解决了冷冻活组织的主要障碍：冰晶。

当水结冰时，它会在组织内部造成严重破坏。水分子从紧密堆积的无定形流体变成刚性晶格。冰晶像刀子一样撕裂细胞。细胞液中的盐在最后冻结的组织部位以有毒水平浓缩。任何冷冻和解冻草莓的人都看到了结果：植物上脱落的糊状变色版本。

使组织低于冰点，同时尽量减少冰块至关重要。（这就是为什么低温生物学家不喜欢说他们“冻结”组织。对于小鼠胚胎，Fahy和他在美國紅十字會的同事William Rall首先將小細胞球浸泡在一種濫化混合物中，這種混合物會浸出大部分水，並用類似汽車散热器防爪液的化學物質代替它。众所周知，这些冷冻保护剂将水分子稀释在粘性流体中，从而阻止冰晶的形成。

然后他们使用–196°C液氮冷却胚胎，保存在细长的塑料吸管中。在快速冷却和冷冻保护剂之间，冰没有时间形成。水分子不是以整齐的晶体图案排列，而是像刚性液体一样卡在一个随机的质量中，这个过程被称为玻璃化。结果是一种坚硬、光滑、玻璃状的物质，没有冰的问题。为了重新加热胚胎，Rall在0°C水中搅拌吸管。

小鼠胚胎工作为储存类似大小的人类胚胎铺平了道路，改变了生育治疗。但是，对于一个大约100个细胞的微小胚胎有效的方法并不容易扩大到整个器官的大小。很难让冷冻保护剂均匀地浸泡到更大的组织中。中心可能需要更长的时间才能凝固，从而促进冰的形成。注入更多的冷冻保护剂来对抗冰可能是有害的，因为这些化学物质是有毒的。

复温会带来自己的问题。如果物体升温太慢，当组织接近冰点时，冰晶会具体化。如果它不能均匀地加热，由不均匀膨胀或收缩引起的应力会像掉在一杯水中的冰块一样使物体破裂。

2002年，Fahy加强了他在小鼠胚胎到兔肾方面的工作。他甚至将先前玻璃化的器官植入动物体内。这只兔子存活了近 7 周。但它是病态的。尸检显示，尽管肾脏的功能足以维持动物的生命，但大部分肾脏都受损了。

从那以后，Fahy一直在解决这个问题，测试不同的化学混合物以及冷却和加热协议。“事实证明，这比我想象的要难，”Fahy说，他现在是私人冷冻保存研究公司21st Century Medicine的执行董事。“我认为所有这些都会得到回报，但我们还没有完全实现。

明尼苏达大学博士后研究员Zonghu Han将大鼠肾脏连接到将称为冷冻保护剂的防冻化学物质和微小氧化铁颗粒泵入器官的管子上。

有充分的理由坚持下去。器官的快速腐烂是困扰人们器官移植的最大问题之一。从人类心脏或肺与献血者断开连接的那一刻起，医生有 4 到 6 个小时的时间将其连接到新患者的血液供应上，以免它受到不可挽回的损害。对于肝脏，窗口期为 8 到 12 小时。对于肾脏来说，大约是 1 天。

这种匆忙给医疗系统和患者带来了负担。外科医生在半夜被叫到医院。移植受者体内插入异物，没有时间进行有助于其免疫系统适应的治疗。超过60%的捐献心脏和肺从未及时到达接受者手中。世界卫生组织估计，只有不到10%需要器官移植的人真正得到器官移植。

冷冻保存提供了器官在植入前可以储存数天、数周甚至数年的可能性。这可以避免器官在几个小时后被扔掉，并使医生能够在需要时更容易地找到器官，或者选择那些与受体免疫学更接近的器官。

“它可以触及生物医学的许多方面，真正改变我们对待健康的方式，”经济学家和前对冲基金经理塞巴斯蒂安·吉瓦（Sebastian Giwa）说，他于2012年创立了非营利组织器官保护联盟。

Giwa帮助成立了几家与冷冻保存相关的公司。其中一个是GaiaLife，正在试验玻璃化卵巢。目标是在人们接受化疗等卵巢损伤医疗之前从他们身上取出产卵器官，然后在治疗结束后重新植入它们。到目前为止，与该公司合作的研究人员已经将玻璃化卵巢重新植入五只绵羊体内；在其中四只动物中，卵巢产生黄体酮，这是它们正在起作用的迹象，生殖生物学家兼该公司首席科学官Alison Ting说。Ting拒绝透露该公司方法的细节，但表示这一进展“让我乐观地说，人类的第一个可能5年内实现。

Zonghu Han戴着防护手套，取出装有大鼠肾脏的容器，冷却至–150°C。极端的温度和冷冻保护剂使器官进入玻璃化状态，其中器官中的液体形成光滑的玻璃状物质，而不是锋利的冰晶。

通过玻璃化动物器官，Fahy展示了关键的第一步，Bischof说。“问题是他无法重新温暖它们。

寻找快速均匀地加热玻璃化组织的方法一直是Bischof实验室的重点。在过去的几年里，他的团队尝试了从激光到导热网格的所有方法。对于较大的物体，如大鼠肾脏，他们已经在强大的磁场和铁纳米颗粒上取得了进展。

在四月一个不合时宜的炎热日子里，UMN机械工程博士后研究员韩宗虎将一根细长的塑料管连接到一个搁在纱布床上的大鼠肾脏上。他在电脑上敲了几下键盘，一股黑色液体开始流入器官。颜色来自悬浮在冷冻保护剂中的铁纳米颗粒。当器官从输液中变成光滑的乌木时，Han将其放入一个小塑料袋中，然后将其放入附近的冷却至-148°C的冰箱中。

肾脏存活的时钟已经滴答作响了 3 个多小时，因为移植外科医生 Rao 在重演 2022 年的突破性手术时将其从大鼠身上取出。现在，随着冰箱内肾脏的温度骤降，逐渐破坏器官的生物过程停止了。“我们已经在移植前储存了长达100天的[大鼠肾脏]，”Han说。“那里无限期地安全。”

在这种情况下，肾脏只有45分钟。韩在一股蒸气中打开盖子，取出一个小小的硬包，里面装着玻璃化器官。他把小包放在一个小金属杯里，这个金属杯子连接着一个奶油色的金属盒。当他按下按钮时，盒子在杯子周围产生了一个磁场，每秒翻转正负极360，000次。这种波动加热了铁颗粒并在90秒内解冻了肾脏。

“这是我们的秘诀，”Bischof在观看时谈到这个过程。

在六月初的一篇Nature Communications论文中，Bischof的团队报告说，将五只大鼠肾脏进行了这种治疗并重新植入。所有接受的动物在被杀死前都活了一个月，以研究它们的状况。现在，研究人员已经着手到猪肾，接近人类肾脏的大小。Bischof拒绝讨论未发表的猪工作的细节。“没有物理理由让我们意识到为什么这种[变暖程序]在较大的器官中不起作用，”他说。

虽然纳米升温，正如Bischof所说的，是他选择的肾脏工具，但它需要昂贵的机械和一次一次的治疗。五月，史密森学会海洋生物学家玛丽·哈格多恩（Mary Hagedorn）在佛罗里达州坦帕郊外的一个实验室测试了比肖夫实验室开发的一种更简单的方法：一种精细的金属网，可以快速传递温度 - 冷和热。她正在成批的珊瑚幼虫身上尝试。如果它有效并且可以扩大规模，Hagedorn认为这个过程可能是她在未来十年内储存数十种珊瑚物种的运动的关键部分，在日益炎热和污染的海洋即将结束之前。

这种网状物已经在明尼苏达州的果蝇幼虫以及夏威夷和澳大利亚的两种蘑菇珊瑚上证明是成功的。在佛罗里达州，Hagedorn及其同事正在Diploria labyrinthiformis上尝试，这是一种脑珊瑚，其幼虫比蘑菇珊瑚大100倍以上。在最初的几次尝试中，重新加热的幼虫正在分崩离析。Hagedorn正在学习的每个幼虫大小都需要自己的治疗版本。“我们正在努力让它发挥作用，”她说。

虽然Bischof和Hagedorn等科学家正在努力解决玻璃化问题，但其他人正在寻求一种更简单的途径，避免需要大量输注冷冻保护剂的超低温，并使复温变得如此具有挑战性。

在哈佛大学和MGH，科学家们正在从大自然中汲取灵感，将组织推到冰点以下，同时阻止冰层。木蛙Rana sylvatica是这个领域的冠军。在北美大部分地区发现，包括寒冷的加拿大北极地区，在低至-16°C的温度下冷冻多达三分之二的身体后，它可以复活。

随着冬天的到来，一连串的生理变化使木蛙做好了在冰冻中生存的准备，MGH生物医学研究员香农·泰西尔（Shannon Tessier）说，他研究了木蛙和其他在接近冰点时冬眠的动物。它的肝脏产生葡萄糖，在组织内起到防冻剂的作用。组织内的抗氧化剂水平增加，防止细胞中氧气量的突然变化造成的损害。木蛙血液中的特殊蛋白质充当冰晶的种子，引导冰生长从更耐用的脉管系统开始，而不是在其他更脆弱的组织中开始。她说，这种变化“是我们想要拉到人体器官和组织的主题”。

在波士顿，包括Tessier在内的一组科学家模仿木蛙，用合成糖淹没人类肝脏，与天然葡萄糖不同，这种糖不能代谢成有毒的副产品。2019年，他们宣布这种方法使他们能够将人类肝脏在-4°C下储存27小时，是捐赠肝脏标准寿命的两倍多。

最近，该团队将这种合成糖与Snomax的输液相结合，Snomax是一种通常用作滑雪场造雪机造雪种子的成分。像木蛙血液中的蛋白质一样，Snomax减缓了冰的形成并将其集中在大鼠肝脏的血管中，使它们能够在-5°C下部分冷冻长达15天，然后在有限的损伤下解冻。五天远远少于玻璃化器官几乎无限的储存时间，但仍然有用，与Tessier合作的Toner说。例如，额外的时间可以让等待器官的患者接受骨髓移植，这是诱使免疫系统接受新器官的一种可能措施。

在这个国家的另一边，鲍里斯·鲁宾斯基（Boris Rubinsky）认为，更高的压力可能会帮助他超冷的器官而不会受到损害。在2000年代初期，加州大学伯克利分校的生物医学工程师鲁宾斯基开始冷却密封金属容器内的物体。当里面的水接近冰点时，它膨胀了，增加了压力。他发现，较高的压力限制了冰的形成。“谦虚地说，这是一种革命性的保存方法，”他说。

4月，研究小组在他们的一个压力室中将猪心脏冷却至-21°C<>小时，然后将其加热并植入另一头猪体内，在那里它开始自行跳动。除了避免完全玻璃化可能带来的挑战外，鲁宾斯基发现他的策略使他能够使用比其他方法更少的冷冻保护剂，从而减少毒副作用。

因为它简单且技术含量相对较低，这种方法也可以用于保存食物，而不会造成冰损害，从而降解当今的冷冻蔬菜和肉类。金属储存室适合标准商用冷冻箱。由于该方法在比通常用于储存冷冻食品的温度更高的温度下工作，Rubinsky及其同事预计广泛使用每年可以减少全球能源消耗超过6亿千瓦时 - 相当于拉脱维亚的年度总电力需求。

木蛙（Rana sylvatica）可以在加拿大北极等地的部分冷冻状态下存活数月。

位于加利福尼亚州奥尔巴尼的美国农业部（USDA）实验室的食品技术专家克里斯蒂娜·毕尔巴鄂-塞恩斯（Cristina Bilbao-Sainz）在鲁宾斯基于2016年向该中心发表演讲后开始研究这种方法。“这是一个简单的想法，但非常新颖，”毕尔巴鄂-塞恩斯说。“我们完全看到了这可能会有未来。

第一次尝试令人沮丧。覆盆子是一种精致的水果，解冻后会变成糊状。然后毕尔巴鄂-塞恩斯尝试了西红柿。将 1 个葡萄西红柿放入装有糖水的密封容器中放置 2 个月，温度为 –50°C。 她说，它们看起来像是刚被采摘的。

毕尔巴鄂-塞恩斯在菠菜、樱桃和土豆方面也取得了不错的成绩。现在，她正在尝试蓝莓。2022 年 <> 月，美国农业部实验室开始与一家有兴趣使用该技术的未具名公司合作。“这可能会产生很大的影响，”她说。

Zonghu Han从储藏冰柜中取出一个玻璃化大鼠肾。肾脏在成功移植到大鼠体内之前已经像这样储存了长达100天。

进步来得很快，足以让那些好莱坞剧本看起来不那么古怪。一些科学家提出了储存在转基因猪中生长的玻璃化人体器官的可能性，以备将来移植。Tessier正在努力保持整个动物 - 微小的斑马鱼幼虫 - 处于假死状态。到目前为止，她已经将它们部分冷冻在-10°C下3天。解冻后，一半的鱼存活下来并继续生长。把人换成鱼，提高成功率，科幻小说的主食最终可能会成为现实。“你甚至可以考虑长期的太空旅行，”Tessier说。

但这与今天相去甚远。仿佛是为了说明愿景与现实之间的差距，UMN演示在最后一步出错了。当黑色纳米颗粒从大鼠肾脏中冲洗时，水在冷却设备上凝结，导致设备故障。它泵送一种通常用于在失控压力下将器官移植到肾脏期间保存器官的溶液。

Han和Bischof沮丧地盯着受损的器官。在这项技术进入手术室之前，它不仅必须扩大到人类的大小，而且还需要通过美国食品和药物管理局等安全监管机构的审查。“我们在实验室所做的所有这些工程都必须做到故障安全，”Bischof指着肾脏说。“这只是一些可能出错的事情的一个例子。