睡眠功能研究将有望取得新突破

睡眠具有重要生理功能，但研究睡眠比较困难，主要是缺乏细胞和分子层面的研究模式。最近《细胞》发表了一项目利用线虫的研究，该研究建立了判断线虫睡眠的方法，并确定了睡眠对特定记忆干扰的效应。由于线虫的神经系统已经有了非常全面的细胞学基础，这一研究将对睡眠生理学研究提供重要的工具。

一项研究表明，线虫需要良好的睡眠来维持与特定气味相关的记忆。

Sleep is required to consolidate odor memory and remodel olfactory synapses: Cell

当训练避免甜味时，秀丽隐杆线虫（秀丽隐杆线虫）线虫仍然可以在 16 小时后记住这样做，只要它们的训练后小睡不中断。但是扰乱他们的睡眠会阻止他们的神经系统发生关键的变化，而神经系统与形成持久的记忆有关。

该研究结果于6月2日发表在《细胞》杂志上1，为科学家深入研究睡眠期间在细胞和分子水平上发生的过程铺平了道路。

“这为一个古老的问题带来了细胞解决方案”，即睡眠的目的是什么？以及睡眠与记忆的关系，该研究的共同作者，加州大学旧金山分校的细胞生物学家Noelle L'Etoile说。

 Sleep loss impairs memory of smells, worm research shows (nature.com)

对包括果蝇、蜜蜂、啮齿动物和人类在内的许多物种研究已经证明，睡眠对于长期记忆至关重要。

L'Etoile和她的同事想调查这是否也适用于秀丽隐杆线虫。研究这种简单生物体的睡眠“可能有助于我们真正了解睡眠的潜在分子和细胞机制”，马萨诸塞州剑桥市哈佛大学的神经科学家Hanna Zwaka说。“我们已经知道线虫所有神经元和突触，这是在其他动物身上没有的条件。”

L'Etoile说，这项研究带来了一个不寻常的技术挑战：确定一毫米长的线虫何时真正睡眠。由于没有四肢或明确的睡眠阶段需要观察，区分熟睡的秀丽隐杆线虫和清醒的秀丽隐杆线虫是一项棘手任务。

研究人员使用基于视频的成像工具来观察数百种线虫，并寻找睡眠的明显特征，例如运动减少，刻板姿势以及在暴露于闪烁的蓝光时似乎“醒来”。

在打盹儿时，“小虫变得笔直，只有头部存在小弯曲”，L'Etoile说。虽然线虫们往往不会四处走动，但线虫也无法抗拒睡眠对进食的影响。“他们的喂食减少了，但并不是零，”她说。

神经科学家目前认为，记忆存在于突触中，突触是神经元之间的化学连接。巩固记忆过程的一部分涉及睡眠期间突触数量的减少，这可以平衡大脑中神经元之间的连接并将它们保持在适当范围内。

L'Etoile说，秀丽隐杆线虫只有302个神经元，是所有生物中最精简的神经系统之一，科学家们已经绘制了线虫的整个连接体，包括所有神经元及其连接突触网络。这使得该物种成为研究睡眠期间突触变化的理想选择。

为了测试线虫的记忆力，研究人员训练它们忽略化合物丁酮的甜味，他们通常认为这种气味对线虫有特别吸引力。该团队通过将气味与食物去除联系起来来做到这一点。这有点类似狗铃条件反射的试验。

线虫使用称为AWC的神经元检测丁酮气味，该神经元连接到一对称为AIY神经元。可以使用GRASP成像工具，可在突触处引发绿色荧光，研究表明，训练线虫避免气味会导致其神经系统中AWC-AIY突触的数量减少。

线虫在训练后也倾向于休息。为了测试这种训练后小睡是否需要维持气味记忆，研究人员通过每15分钟轻轻摇晃它们或移除食物来扰乱线虫的睡眠。

在气味训练后立即享受不间断睡眠的线虫在16小时后对丁酮的气味没有反应。但是那些在训练后前1-2小时内被剥夺睡眠的人比那些没有受到干扰的睡眠的人表现出更强烈的突触连接，并且在16小时后不记得远离丁酮。

“当气味变成凝固的记忆时（长期记忆），它需要睡眠，”L'Etoile说。结果表明，线虫在训练后有一个关键的睡眠窗口大约1-2小时，在此期间睡眠巩固了线虫的记忆。当线虫睡眠在训练后2-6小时被打乱时，它对记忆保留没有这样的影响。

对于费城宾夕法尼亚大学的神经科学家David Raizen来说，下一步将是研究睡眠行为诱导突触数量和强度变化的生化机制。

论文背景和主要结果

了解睡眠中的大脑全局状态如何促进专用回路中特定记忆的巩固，是生物学中最重要的挑战之一。确定一个具有简单、定义明确的神经回路的系统，能依靠睡眠进行巩固，将有助于通过细胞和突触分辨率解决这个问题。从人类到苍蝇再到海兔的动物已被证明需要睡眠来巩固记忆。这些生物体具有庞大而复杂的大脑，范围从果蝇中大约20万个开始到人类860亿神经元。秀丽隐杆线虫有一个紧凑的神经系统，只有302个神经元。神经系统的特征也很明确，已经确定了许多单个神经元的功能，已经阐明了整个突触连接组。因此，秀丽隐杆线虫提供了一个独特的机会来研究睡眠如何影响控制学习和记忆改变的行为的单个神经元之间的联系。

秀丽隐杆线虫的睡眠特征是比较保守的：快速逆转的不动期、唤醒阈值增加、稳态补偿、刻板姿势和神经元活动模式的广泛改变。秀丽隐杆线虫促进睡眠的神经元 ALA，这是压力诱导睡眠所必需的，RIS 是发育定时睡眠所必需的，释放参与GABA能促睡眠回路的保守神经肽和下游途径。正如在其他动物中观察到的那样，秀丽隐杆线虫的这种整体大脑状态显示出神经元活动减少。因此，我们可以通过检查保存记忆的细胞和特定连接来解决这种状态如何影响记忆。

记忆在突触、细胞和系统层面得到巩固；然而，睡眠在这些水平中的作用尚不清楚。学习和记忆被认为是从活动诱导的转录和突触信号传导的变化过渡而来的进入受训练影响的回路内突触结构的物理变化，这一过程称为突触巩固。驱动长期巩固记忆的转录变化需要cAMP反应元件结合蛋白（CREB）。哺乳动物系统和果蝇的工作确立了这些机制的进化保守性。当记忆的物理表现被移动到存储它的不同大脑区域时，就会发生系统整合，并且它的守恒也得到了证明。在睡眠期间，突触可以在许多系统中大脑的广泛区域缩小，这一过程被认为是将突触强度保持在功能范围内。尽管有这些重要的发现，但对睡眠在细胞和突触水平上巩固长期记忆的功能的理解仍然难以捉摸。

在这项研究中，我们首先询问秀丽隐杆线虫，类似于神经系统更复杂的生物体，是否需要睡眠来长期巩固记忆。以前的研究已经阐明了丁酮化学感觉所需的神经元的身份和嗅觉学习。丁酮被AWC感应上，两个AWC嗅觉神经元之一，它们主要与三对中间神经元形成突触：AIY、AIA 和 AIB。使用改编自考夫曼及其同事的培训范式，我们表明嗅觉记忆依赖于训练后的 ALA 依赖性睡眠；如果在关键时期睡眠被机械干扰或从食物中移除而中断，动物就不会巩固记忆。

接下来，我们表明气味训练和训练后睡眠会改变丁酮嗅觉回路。AIB或AIY中间神经元都足以用于丁酮学习。然而，睡眠后，AIY对于记忆巩固更为重要。我们使用跨突触标志神经配素-1（NLG-1）跨突触伙伴的GFP重建（GRASP）可视化AWC化学感觉神经元和AIY中间神经元之间的突触。我们发现，与对照缓冲液训练的动物相比，丁酮训练的动物在训练后16小时显着减少了AWC-AIY连接。训练后立即中断睡眠可以消除这种突触减少。在训练后的前2小时内，对照缓冲液和丁酮训练动物的突触减少，但在接下来的14小时内，丁酮和缓冲液训练动物的AWC-AIY突触水平变得明显。我们的研究表明，在最简单的神经系统之一中，气味记忆巩固和睡眠依赖性突触结构可塑性需要睡眠。这项工作还为理解记忆所需的特定细胞及其连接如何通过气味训练和睡眠进行调节提供了新的精度和粒度。