文章信息

期刊名称：Grassland Research   《草 地 研 究（英文）》

英文标题：Integrated transcriptome and proteome analyses reveal potentialmechanisms in Stipa breviflora under lying adaptation to grazing

中文标题：综合转录组和蛋白质组分析揭示了短花针茅适应放牧的潜在机制

  第一作者：刘雅楠  内蒙古大学生态与环境学院 

                      孙世贤  中国农业科学院草原研究所 

  通讯作者：党振华   内蒙古大学生态与环境学院 

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编译：作者

 说明：如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

摘     要

背景

长期的过度放牧导致草原严重退化，对草原资源的可持续利用构成了重大威胁。

方法

本研究在调查不放牧、适度放牧和重度放牧处理下短花针茅功能性状和光合生理指标的基础上，通过整合转录组学和蛋白质组学分析，评估了不同放牧强度相关的基因和蛋白质表达模式的变化。

结果

在不同的放牧强度下，鉴定出了差异表达的基因和蛋白。它们主要与RNA的加工、碳代谢和次生代谢产物的生物合成有关。这些结果表明，长期放牧导致分子表型可塑性，影响短花针茅的各种生物过程和代谢途径。相关分析显示，转录组和蛋白质组之间的相关性较低，表明在短花针茅对放牧的响应过程中，基因表达在转录后和翻译水平上存在大规模调控。参与光合作用和苯丙素代谢途径的关键基因和蛋白的表达谱表明，它们对放牧的协同响应。

结论

本研究为短花针茅对放牧的适应机制提供了思路，为开发更有效的草地保护和利用实践提供了科学依据。

关键词

功能性状、放牧适应、蛋白质组、光合生理学、转录组、短花针茅

绪     论

草原是陆地生态系统中重要的自然资源。内蒙古草原是欧亚草原的一部分，占中国草原面积的22%（Yu et al.，2020），它是我国西北地区提供生态安全、生态系统服务和稳定的重要生态生物群落。然而，由于近几十年来草原的长期过度放牧和不合理利用，以及气候变化的影响，内蒙古草原已经严重退化。这对区域景观生态产生了负面影响，对牧区草原的可持续发展构成了巨大威胁（Cui et al.，2012；Liu et al.，2017）。放牧是草地资源的重要利用方式，也是草地植物性状变化的主要驱动因素（Zhao et al.，2016）。在自然条件下，植物通过改变其高度、丛宽、茎叶质量和干物质含量等功能性状来适应外部环境胁迫（Li et al.，2014）。以往关于放牧对草地生态系统影响的研究大多集中在宏观层面上，如景观格局和植物群落组成等。许多研究针对植物的功能性状也进行了探讨，但此类研究多集中于植物性状的发展和进化及其与环境变化和压力的关系上。这些研究结果对研究牧草对放牧、草地生产力形成和放牧条件下生产力衰退的响应机制具有重要意义。一些研究表明，草原植物对放牧的响应主要反映在植物的生长模式上，最明显的指标是全株植物的茎和叶（Liu et al.，2019c；Orwin et al.，2018；Wang et al.，2021）。对内蒙古典型草原冰草的功能性状对放牧强度的响应规律进行研究，发现从对照组到极重度放牧其株高和生物量变化最大，叶片数、叶长、叶宽降幅较小（Li et al.，2021）。同时有研究者观察到羊草（C3植物）和隐子草（C4植物）的功能性状在水分丰富和干旱的年份之间也会发生变化，影响最显著的是茎叶性状（Zheng et al.，2010）。在典型草原退化群落优势种糙隐子草的研究中发现，放牧干扰使其株高、茎叶比叶数、平均叶面积、总叶面积峰性状发生了显著变化（Xing et al.，2019）。这种对植物形态特征的响应被认为是预测环境和气候变化影响的重要指标（Lienin & Kleyer，2012）。

草原植物在放牧胁迫下保持生存，逐渐形成了应对食草动物采食的适应性进化防御策略。有些学者将这种防御策略分为避牧性和耐牧性（Rotundo et al.，2007）。例如，植物体内能分泌单宁、萜类、甜菜碱等多种次生代谢产物，可引起家畜采食后的不良反应，其气味亦为家畜不喜（Rotundo & Aguiar，2007；Lisonbee et al.，2009；Srinivasa，2018）。又如大针茅、短花针茅等禾本科植物种子带芒，糙隐子草叶片结构中存在维管束等形态特征，能够降低自身适口性以减少家畜采食，是牧草避牧性的典型表现。植物耐牧性则通过重新分配碳水化合物、增大光合速率、细胞膜渗透调节能力、植物激素分泌等生理生化响应来促进个体的再生，增加对采食的耐受性，提高物种的抗逆能力（Benot et al.，2019；Dang et al.，2021；Zhao et al.，2021年）。在研究荒漠草原牧草响应放牧的生理指标时发现，牧草叶片中游离脯氨酸和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等保护酶活性均呈现出上升趋势（Ma，2008a）。一些研究发现放牧条件下短花针茅分蘖叶内源激素的变化，发现载畜率与小株丛短花针茅的内源激素的浓度存在显著二次相关关系（Jia et al.，2019）。

近年来，在细胞水平上探索草地植物对放牧的响应机制，引起了人们的广泛关注。在模拟放牧条件下，在水稻中发现了与信号转导、miRNA调控、细胞壁修饰、代谢、激素合成和分子转运蛋白相关的基因表达的变化，为了解植物对放牧响应的分子机制提供了见解（Chen et al.，2009）。在苜蓿中，放牧后己糖激酶的表达增加，这表明己糖激酶可能在苜蓿的放牧耐受性中发挥了重要作用（Wang et al.，2016）。通过转录组测序，研究人员研究了与创伤、干旱和防御相关的内源性基因（Wan et al.，2015）。在过度放牧胁迫下，蒙古高原生长的早熟禾可以调控光合作用、氧化磷酸化、蛋白酶、过氧化物酶、脂肪酸降解和Notch信号通路等基因来适应放牧胁迫。虽然已经有大量研究在分子水平上探索了植物对放牧的响应机制，但是目前的研究不足以全面了解不同草原区和不同草原植物的放牧响应策略，因此有必要调查更多放牧处理下、更丰富草原植物的放牧响应机制，以制定合理的草地资源管理、利用及受损草原恢复措施。

短花针茅是内蒙古沙漠草原的优势种，它在保护草原生态系统和维护草原牧区系统方面发挥着关键作用。本研究通过表型观察其形态和光合特性的变化，研究了短花针茅在长期放牧条件下的响应。随后，我们研究了短花针茅在不同放牧强度下的基因和蛋白的表达谱。我们确定了由放牧触发的相关细胞过程和代谢途径，并探索了转录组和蛋白质组之间的非协同表达模式。此外，我们还鉴定并讨论了与放牧和适应反应相关的关键差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs）。

材料和方法

研究地点和放牧强度

放牧试验位于中国锡林郭勒盟苏尼特右旗朱日和镇（E112°47′16.9″，N42°16′26.2）进行，海拔1100-1150米。该地区年平均降水量183.0 mm，年平均气温5.8 C，属温带大陆性气候。试验区内土壤为地带性分布的淡栗钙土，是荒漠草原向荒漠过渡的地带性土壤。放牧实验于2010年开始，每年5月开始放牧，10月底终止，期间采用连续放牧的方式，夜间羊群不归牧，不进行补饲。每个试验区的面积为2.60 hm2。采用无放牧（NG，无羊）、适度放牧（MG，1.92 sheep·ha^-1）和重度放牧（HG，3.08 sheep·ha^-1）。

植物材料收集

短花针茅样本采集于2020年8月9日在一个阳光明媚的日子里上午09点至11点。从3个不同放牧处理的样地中随机抽取10丛健康、成熟、间隔相似的短花针茅。收集幼叶，立即用液氮冷冻，在−80C下保存，用于后续的转录组测序和定量蛋白（IBT）分析。每个放牧处理设置3个生物重复。

功能性状和光合生理学的评估

利用LI-6400便携式光合作用系统（Li-COR，Linkin，NE，USA）测量光合生理指标，包括净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率(E)和细胞间二氧化碳浓度（Ci）等指标。测定了植物营养分蘖高度（VH、cm）、生殖分蘖高度（RH、cm）、中心高度（CH、cm）、叶数(LN、piece）、丛宽度（CW、cm2）、干茎干重(SDW、g）、叶干重(LDW、g）、叶片饱和鲜重(LSFW、g）、叶面积（LA、cm²）等功能性状。分别使用Excel 2019和SPSS19.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）软件对各功能性状和光合生理指标进行统计学分析。在p＜0.05时，采用单因素方差分析（ANOVA），评价放牧处理间各功能性状和光合生理指标差异的显著性。数据以平均±标准误差表示，并使用Origin 9.0(Origin Lab, Northampton, MA, USA)。

RNA提取及cDNA文库构建

根据制造商的说明，使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)从每个样本中提取总RNA。使用Agilent2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)检测RNA的完整性。用Oligo（dT）磁珠分离mRNA，逆转录后获得cDNA。修复片段末端，进行聚合酶链反应（PCR），然后进行poly (A)连接和片段长度选择，构建cDNA文库。最后，利用BGISEQ-500平台对每个样本的cDNA文库进行对端测序。

RNA-seq数据过滤和生物信息学分析

使用Trimmomatic (version 0.36) 对所有样本的原始序列进行过滤（Bolger et al.，2014）。该过程包括去除被适配器污染的reads、低质量reads（定义质量值低于15的碱基占该Reads总碱基数的比例大于20%的Reads为低质量的 Reads）和未知碱基N含量大于5%。使用SOAPnuke (version 1.4.0)对得到的clean reads进行计算（Chen et al.，2018）。对于每个样本的clean reads 使用Trinity (version 2.0.6) (Grabherr et al., 2011) 进行组装，优化的k-mer长度为25。随后，使用TGICL（2.1版）（Perteaetal.，2003）进行聚类和去冗余处理，得到了一个unigenes的集合。从所有样本中获得的unigenes进一步使用TGICL进行聚类，生成不可扩展的非冗余 All-Unigene 用于后续分析。为了评估组装好的转录组的完整性，我们使用了真核生物数据库中的303个保守序列进行了BUSCO分析（Simao et al.，2015）。

使用 Bowtie2（2.2.5）将每个样本的 Clean Reads 映射到合并后的转录组中(Langmead & Salzberg, 2012),根据比对结果，采用 RSEM（1.2.8）(Li & Dewey, 2011)对每个样本的映射 Reads 进行定量，用TPM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped reads，transcripts per kilobase per million mapped reads，即每千个碱基每百万映射的转录本）将基因的表达水平进行标准化。使用BLASTX对转录本与公共数据库中的序列进行功能注释，并将显著性阈值设置为E-value≤10⁻⁵。所使用的数据库分别为NR、Swiss prot, COG和KEGG。根据NR注释，使用Blast2GO（version 2.5.0）（Conesa et al.，2005）对所有转录本的基因本体（GO）功能进行注释。采用DESeq2鉴定两种放牧处理之间的DEG，以|log2 (fold change)| ≥ 1 ，错误发现率（FDR）≤0.05作为差异表达基因的阈值。此外，使用MapMan (version 3.6.0) 对每组比较下的DEG进行GO和KEGG富集分析（Thimm et al.，2004）。

蛋白质制备

在适量的短花针茅中加入5% PVPP粉末和适当体积的匀浆缓冲液；然后使用研磨机将混合物磨碎，加入两倍体积的三饱和苯酚，用力摇晃混合物并离心；收集上苯酚相，加入5倍体积为0.1molL⁻¹的冷乙酸铵/甲醇和二硫苏糖醇（DTT），最终浓度为10 mmolL⁻¹，然后离心，这些步骤重复了两次；加入1mL冷丙酮，-20℃冰箱放置30min，离心15min，弃上清，重复该步骤一次；风干沉淀，加入适量有 SDS L3、终浓度为含 EDTA的 1×Cocktail 混匀，置于冰上5min 后，加入终浓度10mmol L⁻¹DTT；使用研磨仪（频率为 60Hz，时间为 2min）破碎裂解，25,000g下离心15min，弃上清，加入终浓度为10mmol L⁻¹的DTT放入56℃中水浴1h；加入终浓度为 55mmol L⁻¹的 IAM，暗室放置 45min；加入1 mL冷丙酮，−20℃冰箱放置2h，25000g离心15 min；弃上清液，风干沉淀物；加入适量的无SDSL3溶液，使用研磨仪（频率为 60Hz，时间为 2min）破碎裂解；得到的上清液含有蛋白质，放在−80℃保存直到进一步分析。

液相色谱与串联质谱分析

每个组分在装载缓冲液（5 mmol L⁻¹ 含2%乙腈的甲酸铵[ACN]；pH 10）中重悬，并在超性能LC系统（Waters）上使用高氢反相液相色谱（RPLC）进行分离。溶剂A和B分别由2%的ACN（pH 10，用氨调整）和80%的ACN（pH 10，用氨调整）组成。

在高pH RPLC (C18, 1.7 μm, 2.1 mm × 150 mm;Waters)柱上进行梯度洗脱，从0B溶剂开始，在2-38 min以上增加到30%溶剂B，然后从38到40 min的梯度从30%到100%溶剂B。

蛋白质定量与生物学分析

采用华大自主研发的IQuant软件进行IBT定量分析，在谱图/肽段水平进行1% 的FDR过滤（FDR ≤ 0.01），接着基于“简约原则”，利用肽段进行蛋白组装，并产生一系列的蛋白质。在蛋白水平上以 FDR 1%再次进行过滤，以控制蛋白的假阳性率，并利用 CV 值来评估定量的重复性。以 |log2(fold-change)| ≥1.5，P ≤ 0.05 的标准确定显著的DEPs。使用GO、KEGG和KOG富集分析进行功能注释，并对DEPs进行亚细胞定位分析。

转录组与蛋白质组数据的相关性分析

将 CK、MG和 HG的短花针茅转录组与蛋白质组两两比较后进行关联，当某一个蛋白质在转录组水平有表达量时被认为关联。并根据蛋白质水平和转录本水平的变化水平，将蛋白质分为9个象限，随后进行富集分析。

Stipa breviflora差异蛋白验证

2022年8月，在与转录组和蛋白质组测序相同的放牧地采集了短花针茅的叶片样本。用高效液相色谱法对叶片中的蛋白进行顺序提取、酶解和分离。此外，采用Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific)对目标蛋白进行PRM质谱分析,运用软件Skyline对PRM原始文件进行数据分析（MacLean et al，2010年）。

结     果

不同放牧强度下短花针茅的功能性状

不同放牧强度下，短花针茅的景观特征存在显著差异。由图1可见，随着放牧强度的增加，样地暴露的土壤表面积增加，植物群落冠层高度降低，地上生物量（包括凋落物）减少。

图1 三种放牧梯度样地植被状况（拍摄于2020年8月9日）。

研究了不同放牧条件下短花针茅植物的功能性状。在不同强度下，随着放牧强度的增加，有抑制生长的趋势。在被调查的性状中，RH、LDW、LSFW、LA、CW在不同的放牧处理下差异显著（p＜0.001），其次是LN和CH（0.01＜p＜0.05）。与NG相比，MG和HG条件下的RH分别显著增加了78.64%和74.78%（p＞0.05）。在MG条件下，CH和CW比NG分别增加了31.86%和88.77%。相应地，在MG条件下，LDW、LSFW和LA分别显著增加了44.45%、38.12%和58.08%（图2）。

图2 不同放牧强度下短花针茅的功能性状。误差条上方的字母表示两种放牧处理的比较之间存在显著性差异（p < 0.05），该值代表平均± SE。各放牧处理的功能性状（生殖枝高，RH；营养枝高；VH，丛幅，CW；中心高，CH；叶数，LN；叶片饱和鲜重，LSFW；叶面积，LA；叶片干重，LDW；茎干重，SDW）代表10丛短花针茅的平均值。汞，大量放牧；MG，适度放牧；NG，不放牧。

与NG相比，放牧条件下的9个功能性状（HG中的LDW和LSFW除外）均呈负偏差。在塑性指数（PI）方面，MG条件下RH、RH、NH、CH、LDW、LSFW、LA和CW的变化均高于HG条件下，HG条件下LN和SDW高于MG条件下。在所有性状中，RH、LN和CW的PI偏差最大，可作为短花针茅对放牧的敏感性指标（表1）。

不同放牧强度下短花针茅的光合生理特征

在不同放牧处理下，短花针茅的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（E）随着放牧强度的增加显著增强（p＜0.05），表现为 HG＞MG＞CK；胞间CO₂浓度（Ci）没有显著变化（p＞0.05）。

图3 不同放牧处理下短花针茅的光合特征。误差条上方的字母表示差异显著（p < 0.05）。数据用平均± SE表示。放牧强度用NG、MG和HG表示。各放牧处理的光合生理指标（净光合速率，Pn；细胞间二氧化碳浓度，Ci；蒸腾速率，E；气孔导度，Gs）代表10丛短花针茅的平均值。HG，大量放牧；MG，适度放牧；NG，不放牧。

转录组测序、从头组装、基因定量和注释

测序后,9个短花针茅样品在Q20水平获得56.94 GB的 Clean Reads(误差概率为1%)。将所有长度为150 bp的样本对端Clean Reads从头组装成49,690-58,368个Unigenes，N50值在1630-1812bp之间。此外，对这些Unigenes进一步组装和去冗余后，最终得到 124,728条All-unigenes，N50为2111bp(表S1)。BUSCO分析显示，对比真核生物数据库中的303个保守序列，最终组装的非冗余转录组数据集的全序列占92.74%，这表明了组装好的转录组的完整性（图S1）。基因定量结果显示，NG和MG处理下的3个重复的总体表达模式具有高度可重复性，而HG3样本与HG处理的其他两个重复（HG1和HG2）存在显著差异（图S2）。因此，该样本被排除在以下分析之外。此外，在每个放牧处理的生物重复中，以CV≤0.7，TPM≥1.0为阈值，保留了34,552 All-Unigene进行后续分析。功能注释显示，通过BLAST比对到公共数据库，获得了32,236个（93.30%）的 all‐unigenes。其中，31,746（91.88%）、26,651（77.13%）、26,367 （76.31%）、26,171（75.74%）和25,493（73.78%）分别注释到NR、KEGG、GO、KOG和Swiss‐Prot数据库中（表S2）。

对DEG的亚细胞定位的鉴定、富集分析和预测

在分析的数据集中，通过对三种放牧强度的两两比较，共鉴定出了558个DEG（图4b）。其中，MGvsNG中发现275个DEGs（153个上调，122个下调），HGvsNG中发现212个DEGs（88个上调，124个下调），HGvsMG中发现209个DEGs（103个上调，106个下调）（图4a，b）。GO富集分析显示，DEGs主要富集在GO数据库中的三个主要类别（分子功能、生物过程和细胞成分）中，如叶绿体基质（GO：0009570570）、RNA结合（GO：0003703723）、细胞质(GO：000587）、叶绿体 (GO: 0009507)（图S3）。在MGvsNG中，最丰富的三个GO条目分别是叶绿体基质（GO：0009570）、叶绿体（GO：0009507）和RNA结合（GO：0003723）。

在HGvsNG和HGvsMG中，细胞质（GO：0005829）是最富集的GO条目（图4c和图S4）。KEGG富集分析显示，DEGs在RNA运输、昼夜节律和苯丙素生物合成途径中显著富集（图S3）。对于MGvsNG中，RNA转运、剪接体和mRNA监测通路相对丰富。对于HGvsNG和HGvsMG中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解；丙酸代谢；ABC转运体磷酸戊糖途径是最显著的富集途径（图4c和图S4）。亚细胞定位分析显示，在所有DEGs中，527个（94.44%）被分配到某些细胞部分，其中三个显著的组中最主要的基因涉及到叶绿体（34.76%）、细胞核（23.11%）和细胞质（15.23%）（图S5）。

图4 差异表达基因（DEGs）的表达谱分析和富集分析。DEGs的(a)维恩图。DEGs的(b)聚类分析。(c)基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）对两种放牧强度之间的基因富集分析。使用ClueGo（版本2.5.9）和GluePedia（版本1.5.9）选择了显著富集的（q≤0.05）GO术语和KEGG通路中包含的deg并进行可视化。放牧强度分别为NG（无放牧）、MG（中等放牧）和HG（重度放牧）。

蛋白质的鉴定和定量

 9个样品共测定了729,266个光谱和12,230个肽段。肽段长度约为7-17个氨基酸（aa），其中9-12个aa区间为峰面积，占所有肽段的42.52%。根据FDR≤1%的标准，共鉴定出4455个蛋白（表S3）。CV分析显示，超过85%的蛋白质的CV 值小于 30%，说明样品重复性较好（图S6）。鉴定最多的蛋白（75.82%）的分子量在10~60aa之间（图S7），覆盖率为1%-40%的蛋白占所有蛋白的94.19%（图S8）。

DEPs亚细胞定位的鉴定、富集分析和预测

不同放牧处理共鉴定出541个DEPs（图5b）。在所有的DEPs中，MGvsNG中有253个DEPs（203个上调，50个下调），HGvsNG中有110个DEPs（48个上调，62个下调），HGvsMG中有419个DEPs（325个上调，94个下调）（图5a，b）。GO富集分析显示，在三个主要的GO类别中，DEPs主要注释为结合（GO：0005488）、单加氧酶活性（GO：0004497）、碳固定（GO：0015977）和细胞核（GO：0005634）（图S9）。对于MGvsNG，GO富集分析显示，DEGs主要富集在膜的完整组成部分（GO：0016021）、剪接体小核糖核蛋白复合物（GO：0097525）和叶绿素结合（GO：0016168）。在HGvsNG中，DEPs主要富集于调控分生组织生长（GO：0010075）、线粒体呼吸链复合物I（GO：0005747）和转录调控（GO：0010630）。对于MGvsHG，DEPs主要富集于线粒体呼吸链复合物I（GO：0005747）、还原戊糖-磷酸循环（GO：0019253）和防御反应的负调控（GO：0031348）（图5c和图S10）。KEGG富集分析显示，464个DEPs在102条KEGG途径中富集（图S9）。在MGvsNG中，DEPs主要富集于剪接体和植物-病原体相互作用途径。在HGvsNG和MGvsHG中，DEPs主要富集于光合生物的碳固定以及光合作用和乙醛酸和二羧酸代谢中。在MGvsHG中，DEPs主要富集于苯丙素生物合成途径中（图5c和图S10）。亚细胞定位分析显示，在所有DEPs中，540个（99.814%）被分配到某些细胞部分，其中与叶绿体相关的（37.52%）、细胞质（29.39%）和细胞核（14.6%）（图S11）。

图5 差异表达蛋白（DEPs）的表达谱和富集分析。DEPs的(a)维恩图。DEPs的(b)聚类分析。(c)基因本体论（GO）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）对两种放牧强度之间的DEPs进行了富集分析。使用ClueGo（版本2.5.9）和GluePedia（版本1.5.9）选择了显著富集的（q≤0.05）GO条目和KEGG通路中包含的DEPs并进行可视化。放牧强度分别为NG（无放牧）、MG（中等放牧）和HG（重度放牧）。

转录组与蛋白质组的相关性分析

对不同放牧处理下短花针茅的转录组和蛋白质组进行综合分析发现，MGvsNG、HGvsNG和HGvsMG分别有2735、2815和2875个蛋白/基因被分配到9个象限（图6a-c）。只有一小部分相关的转录本和蛋白质表现出显著的正相关或负相关（象限1和9，以及3和7）。然而，大多数相关的转录本和蛋白质在转录组水平（象限2和8）或蛋白质组水平（象限4和6）上都有差异表达（图6a-c）。相关的DEGs和DEPs富集分析显示，发现大多数DEG和DEP仅在单个组学水平上差异表达，在碳代谢和次级代谢物生物合成相关的GO条目和KEGG途径中富集，如叶绿体、细胞质、光合作用和苯丙素（图6f，g）。这些生物过程或代谢途径可能与短花针茅对放牧、生长恢复和防御机制损伤的响应密切相关。

图6 不同放牧强度下短花针茅的转录组-蛋白质组相关分析和功能富集分析。散点图（a-c）表示在这9个象限中的转录本和蛋白质的相关性分析。x轴和y轴分别表示蛋白质和转录本水平的折叠变化[log2 (fold change)]。圆圈1-9表示象限数，正方形内的数字表示相关转录本和蛋白质的数量。气泡图（d和f）分别显示了象限1、9、3、7和象限2、8、4和6中相关转录本和蛋白质的基因本体论（GO）富集分析结果。气泡图（e和g）分别代表了京都基因和基因组百科全书（KEGG）对象限1、9、3、7和象限2、8、4和6中的相关转录本和蛋白质的富集分析结果。气泡的大小表示GO和KEGG通路中的转录本/蛋白质的数量，颜色表示富集转录本或蛋白质的 q value。放牧强度分别为NG（无放牧）、MG（适度放牧）、HG（重放牧）。

与苯丙素代谢相关的DEG/DEP

本研究发现DEGs/DEPs显著富集到了苯丙烷类生物合成代谢通路。该途径涉及苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸辅酶a连接酶（4CL）、反式肉桂酸4-单加氧酶（C4H）、肉桂酰辅酶a还原酶（CCR）、肉桂酰醇脱氢酶（CAD）、过氧化物酶（POD）和阿魏酸5-羟化酶（F5H）等酶。其中，PAL（CL13827.Contig23_All）、C4H（CL7463.Contig6_All）、4CL（Unigene1256_All）、F5H（CL6399.Contig2_All）相关DEGs在MG时表达下调，随着放牧强度的增加，在HG上调表达。CCR（CL4189.Contig4_All）相较于CK在MG时显著上调，在HG有所下调但高于CK。不同放牧条件下的POD成员表达趋势不同，POD(CL8091.Contig1_All、CL5808.Contig2_All)在中度放牧时表达上调，在重度放牧时下调；POD(CL5308.Contig8_All）随着放牧强度的增加持续增加；POD(CL9961.Contig3_All、CL8302.Contig4_All、CL8004.Contig2_All)在MG时下调，在HG时上调。C4H（tr|A0A446Q3U3|）在MG时显著上调表达，在HG时轻微下调，变化不明显。相较于CK，CCR（tr|A0A0B5EBL5|）在MG时显著上调，在HG有所下调但高于CK。CAD（tr|I1I1X8|）在放牧影响下下调，但随着放牧强度的增强，到HG时有所上调。POD（tr|A0A453APL7|）和POD（tr|A0A3B6SHD7|）均有随着放牧强度增强而上调表达的趋势，而PODs（tr|A0A0Q3H376|、tr|A0A446LP13|、tr|A0A446YUR1|、tr|A0A1D5UL37|、tr|A0A453APM5|、tr|M0Y0D4|、tr|I1GR63|和tr|I1HF22|）在MG时上调，在HG时下调。

图7 苯丙素代谢途径中差异表达基因/差异表达蛋白（DEGs/DEPs）的表达模式。每个酶旁边的热图代表了表S4中所示的DEGs和DEPs的表达谱。圆和正方形分别代表DEP和DEG。横坐标从左到右表示。MGvsNG，HGvsNG，MGvsHG。CAD，肉桂酰醇脱氢酶；CCR，肉桂酰辅酶a还原酶；C4H，肉桂酸-4-羟化酶；F5H，阿魏酸5-羟化酶；HG，重放牧；MG，适度放牧；NG，无放牧；PAL，苯丙氨酸氨解酶；4CL，4香豆酸辅酶a连接酶。

光合作用相关的DEGs/DEPs

本研究识别到的DEGs/DEPs显著富集到了光合作用相关代谢通路，涉及rbcS、光合体系II（PSII）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDHases）、细胞色素b6f（Cytb6f）、硫氧还蛋白（Thioredoxin）、铁氧化还原蛋白（Fd）、ATP合酶（ATP synthase）等酶。在不同的放牧强度下，观察到不同的表达模式（图8和表S5）。rbcSs(tr|M8AQ24､tr|M7YD23 )，GAPDHase(tr|A0A446MF32)，PSII（tr|H6BDG6､tr|A0A446KDG4､tr|M8A4S9、tr|Q40065、tr|I1GQI0、tr|A0A453N6V3、tr|A0A218L9M4、tr|A0A218LVT5、tr|A0A3B6H4W6)和光合体系I（PSI）(tr|A0A452XCG8)在MG条件下表达上调，在HG条件下表达下调，但其改变程度不同。值得注意的是，在放牧条件下，PSII(CL4643.Contig2_All)和PSI (CL3162.Contig3_All) 高表达（TPM≥100.0），特别是在MG条件下。Cytb6fs（|A0A287HT89、|A0A453PTL2和|A0A218LZS6）在MG条件下上调，而在HG条件下显著下调（约为MG的0.58倍）。Thioredoxin(tr|A0A0Q3HXD0)在适度放牧下被激活,在重度放牧下下调。随着放牧强度的增加，Fd(tr|I1GL62)的丰度在HG下较MG显著上调了约1.56倍)。ATP synthase(CL4704.Contig6_All)随着放牧强度的增大而减小，在HG显著下调(约为MG的0.49倍），ATP synthase(CL7658.Contig1_All、tr|A0A3G1AZ27、tr|A0A446LLL7）相比CK在MG显著上调1.4~5倍,在HG放牧下显著下调(约为MG的0.19~0.86倍)。Thioredoxin(CL7849.Contig1_All)基因的表达量均大于100，在放牧后，MG相比CK显著上调了3倍,在HG放牧下下调至MG的0.65倍。

图8 光合电子传递链通路中差异表达基因/差异表达蛋白（DEGs/DEPs）的表达模式。每个酶旁边的热图代表了表S5中所示的DEGs和DEPs的表达谱。圆和正方形分别代表DEPs和deg。横坐标从左到右表示。MGvsNG，HGvsNG，MGvsHG。Cytb6f，细胞色素b6f；HG，重度放牧；MG，中等放牧；NG，不放牧；PSI，光系统I；PSII，光系统II。

差异蛋白验证

使用PRM方法共验证了35个DEPs。PRM结果与通过IBT分析获得的定量结果总体一致，并显示这些蛋白在2020年至2022年之间的表达模式一致（图12S）。

讨论

不同放牧强度下短花针茅的形态学和光合生理表型发生了变化

在长期放牧干扰下，草地植物的功能性状会发生协同变化（Carrasco et al.，2017）。在本研究中，MG条件下的RH、CW等性状较NG条件下显著增加（p < 0.05）。与MG相比，HG条件下CH、CW、LDW、LSFW和LA显著降低（p < 0.05）（图2）。这一发现与Belsky提出的补偿性增长模型相一致，特别是超补偿性增长的概念。植物受放牧采食或其它损伤干扰时，可促进植物生物量的积累，使植物净积累量超过未损伤植株，从而更有利于植物的生长。相反，等补偿生长是植物被采食或损伤后净积累生物量不发生显著变化，对自身生长几乎没有影响（Belsky，1986）。例如，一些研究通过不同放牧强度试验，研究了荒漠草原植物赖草、长芒草、糙隐子草和牛枝子4 种牧草的地上净初级生长量，发现荒漠草原植物在放牧干扰下存在超补偿性生长情况，降低放牧强度有利于超补偿和等补偿生长的出现。这些结果表明，在MG条件下，短花针茅明显存在超补偿生长，证实了MG有利于提高牧草再生能力的观点。在本研究中，短花针茅的功能性状随着放牧强度的增加而发生显著变化（表1）。短花针茅功能性状的可塑性指数（PI）显示，所测功能性状均为短花针茅响应放牧的敏感性状，特别是RH、LN和CW。此外，短花针茅功能性状的可塑性程度不同可能是由于功能性状对放牧干扰的敏感性不同。这可能会改变其生长、繁殖和防御等生物学功能，表现出性状之间的权衡，这可能是该植物应对放牧干扰的适应策略（Guo et al.，2017）。

光合作用是植物生产力的决定因素 (Flexas & Carriquí, 2020; Li et al., 2021;Ma et al., 2021)。根据之前对短花针茅植物光合作用日动态的研究表明，植物的电子转移速率、Rubisco酶活性、光合速率、E、Gs和Ci在09：00-10：00这一时期是短花针茅光合作用中最活跃的阶段（Lei et al.，2021）。在本研究中，我们测量了该时期的光合生理指标，并观察了不同放牧强度下短草植物光合作用的差异。这表明，该植物在不同的放牧强度下，已经发育出了不同的生长发育模式。

在放牧后牧草的再生长过程中，光合作用的变化可分为短期生理伤害和长期生理调整 2 个阶段。前者在动物放牧后立即发生，最多持续2天，而后者可以持续数周。在长期的生理调节阶段，植物提高光合速率和光合作用，增加同化物积累，促进牧草的补偿生长，适应放牧胁迫导致的LA下降（Hou et al.，2002）。虽然放牧导致光合器官的损害和牧草细胞含量的下降，但放牧区植被覆盖的减少间接改善了土地水分保持和通过稀疏冠层的光传递，从而促进光合循环利用。放牧后的再生主要是具有较强光合能力的嫩叶，有效诱导牧草对放牧的积极响应，促进补偿性生长（Yuan et al.，2020；Zhu et al.，2013）。对典型草原不同放牧强度下羊草的光合生理特性分析发现，其光合速率随着放牧强度的增大而增大（Mi et al.，2015）。这与我们的研究结果是一致的，随着放牧强度的增加，短花针茅的三个光合生理指标呈现相同的趋势（图3）。此外，随着放牧强度的增加，叶片数量和茎的生物量的增加也有所增加。因此，这些性状共同促进了放牧后短花针茅生物量的积累和长期放牧胁迫下表型适应特征的形成。

短花针茅的转录组和蛋白质组对放牧胁迫无协同反应

 转录组和蛋白质组代表了基因表达的不同阶段。许多研究报道，仅分析转录组或蛋白质组的变化并不足以理解基因在特定生理状态、生命过程、压力适应和其他过程中的功能模式（Lou et al，2018；Zhang et al，2019；Zhu et al，2022）。然而，通过对转录组和蛋白质组的综合分析，可以更全面地了解植物与环境变化的相互作用，并为揭示相关的分子机制提供了更可靠的信息（Zhang et al.，2019）。在本研究中，我们采用基于RNA-Seq和IBT的定量分析，确定参与短花针茅对放牧胁迫响应的关键DEGs和DEPs。结果表明，放牧干扰下，转录组与蛋白质组的共表达模式较低，表明不同放牧强度下，该植物在转录后和翻译水平存在大规模调控。这与之前的研究结果一致（Ding et al，2020；Lou et al，2018）。例如，对枇杷的转录组和蛋白质组的比较分析显示，在3620个基因中，只有27个DEGs在蛋白水平上表现出协同变化，这与其耐寒特性密切相关（Lou et al.，2018）。在短花针茅中，DEGs和DEPs的不相关水平主要与光合作用、苯丙素代谢和谷胱甘肽代谢等关键酶有关，这可能为探索该物种对放牧响应的相关分子机制提供线索。

植物防御相关的DEGs/DEPs有助于短花针茅对放牧的适应

食草动物的啃食会导致牧草遭受机械损伤并引发级联的生物和非生物胁迫。在植物损伤修复过程中，木质素在其中发挥着重要的角色，其含量的增加能够促进植物的损伤修复，并增强其机械防御能力。对于牧草的避牧来说，上述化合物的积累可以降低牧草的适口性，增加牧草的消化难度，从而减少牧草的采食频率（Zhao & Dixon，2011）。

苯丙烷类植物的生物合成和代谢在植物抵御生物和非生物胁迫中起着至关重要的作用（Tato et al.，2013）。通过上调苯丙素生物合成途径的酶，植物产生多酚类化合物，如酚酸、黄酮和木质素，有助于耐胁迫和抵御病原体（Shafi et al.，2015）。苯丙素代谢由PAL、C4H和4CL催化的三种酶促反应开始。这些步骤产生p-香豆素酰辅酶A，是由CHS和CHI组成的类黄酮合成的分支途径的共同前体（Zhang et al.，2016）。此外，由C4H和对香豆素酰辅酶A合成的对香豆酸也是单酚合成途径的关键前体。在放牧胁迫后，大针茅和羊草会产生大量总黄酮、酚类及木质素等次生代谢物，并以叶片为主要的合成及储存器官（Li et al.，2020）。在短花针茅中，PAL (CL13827.Contig23_All)，C4H (CL7463.Contig6_All)和4CL（Unigene1256_All）在MG下轻微下调，在HG下显著上调。C4H（tr|A0A446Q3U3|）在放牧后显著上调，特别是在MG。CHS和类黄酮代谢途径的CHI3在MG中显著下调，而在HG下显著上调。因此，提示短花针茅可通过增加PAL、C4H、4CL的酶活性，促进总酚类、类黄酮和木质素的合成，继而促进羊采食后短花针茅的创面愈合，同时使其形成耐牧和避牧特性。

木质素合成的下游调控主要涉及酶CCR和CAD。有研究表明，随着放牧强度的增加短花针茅叶片厚壁组织的厚度呈先减小后增加的趋势。厚壁组织的细胞壁中含有木质素，这种结果可能和植物体的避牧策略有关(Sachura. et al., 2023)。与NG相比，短花针茅CCR（CL4189.Contig4_All,tr|A0A0B5EBL5|)在 MG 处理下分别显著上调了约 2.38和1.91倍，在 HG 处理下分别上调约1.64和1.34倍。CAD（tr|I1I1X8|）在MG条件下略有下调，在HG条件下显著上调1.53倍。这表明，CCR和CAD在HG作用下均受到正向调控，促进放牧后植物的木质素合成和次生细胞壁增厚，从而促进伤口快速修复，减少放牧造成的机械损伤。

F5H是另一种参与木质素合成的关键酶，在丁香基木质素（S木质素）的生物合成中起着重要的调控作用。有研究报道，在转基因烟草和过表达F5H的拟南芥中，S木质素含量显著增加，而G木质素的生物合成显著受到抑制（Franke et al.，2000；Siboutetout.，2002）。此外，木质素的含量和组成的变化也会影响到植物的理化性质。当S木质素与G木质素的比值发生变化时，会影响植物诱导和防御基因的诱导水平，导致愈创木基含量较高的植物中更多的防御基因的表达（Gallego- Giraldo et al.，2018）。在短花针茅中，F5H(CL6399.Contig2_All)在MG条件下下调，在HG条件下显著上调了约3.9倍，推测其可能通过调节S/G木质素的比例影响短花针茅牧后生长，并诱导其他防御基因，形成短花针茅的放牧适应性。

有研究发现，在重度放牧条件下，冰草、冷蒿、短花针茅、无芒隐子草、银灰旋花等植物的POD活性显著增加（Aodeng，2004；Xiu，2015）。本研究发现，不同放牧条件下POD基因家族之间的表达模式存在差异。这些POD的差异表达表明，该基因家族是短花针茅对放牧响应的敏感因素，在清除放牧胁迫导致的自由基积累中发挥作用。其中，POD (CL9961.Contig3_All)高表达（平均TPM：72）；POD (CL5308.Contig8_All，tr|A0A0Q3H376，tr|M0Y0D4)在MG下显著提高了2-5倍，在HG下显著提高了1-6倍，表明POD在不同放牧强度下显著调节苯丙素代谢。

在对短花针茅苯丙素代谢途径中基因和蛋白的表达模式进行评估后，许多基因（如C4H和POD）的转录本和蛋白水平存在差异。这表明该物种对放牧胁迫的途径具有较高的敏感性，涉及对基因表达和蛋白质合成的微妙调控。这一调控的细节可能受到植物种类、胁迫类型和环境条件等因素的影响（Zhu et al.，2022）。

植物生长相关的DEGs/DEPs有助于短花针茅对放牧的适应

家畜的放牧和践踏活动会损害植物的地上部分，使植物叶片暴露在强光下，进而影响植物光合作用（Liu et al.，2019）。在放牧条件下，光强度超过了对碳同化的需求，使得PSII对光胁迫敏感，容易受到损害 (Aro et al., 1993; Liu et al., 2019b; Takahashi & Badger, 2011)。在本研究中，PSII（|H6BDG6、|A0A446KDG4、|M8A4S9、|Q40065、|I1GQI0、|A0A453N6V3、|A0A218L9M4、|A0A218LVT5、|A0A3B6H4W6和|B3SH89）和PSI（|A0A452XCG8）在MG下被激活，在HG下轻微下调。PS II（CL4643.Contig2_All)、PSI（CL3162.Contig3_All）基因的表达量均大于100，相比CK在HG下轻微下调。在HG条件下，PSII和PSI相关基因和蛋白的表达下调，提示短花针茅的光系统受损。这可能是通过减少光吸收来减轻过量光能引起的光损伤的一种机制。此外，在MG条件下，短花针茅的电子转移速率可能会增加，从而导致PSII活性增强，光合能力提高（Yan et al.，2013）。因此，在放牧胁迫下，短花针茅经历不同程度的光系统胁迫。与NG和HG相比，MG更有利于短花针茅的生长和存活，符合放牧的适度干扰假说。

在水稻中加入羊唾液后，ATP synthase beta chain蛋白的表达会下调（Fan et al.，2011）。在短花针茅中，ATP合酶(CL4704.Contig6_All)的表达量随着放牧强度的增加而降低，在HG条件下的表达量显著下调（约为 MG 的0.49倍）。ATP synthase(CL7658.Contig1_All、tr|A0A3G1AZ27、tr|A0A446LLL7）相比CK在MG显著上调了1.4~5倍,在HG下显著下调(约为MG的0.19~0.86倍)。结果表明，MG条件下ATP产生效率最高，HG条件下降低。这可能是由于HG作用下植被暴露的增加和光强度的增强，导致光系统受损，进而影响光合作用相关蛋白的水平和ATP的合成。研究证实，PSII的光损伤率受到ATP合成的影响 (Allakhverdiev et al., 2005)，这与本研究的结果一致。

为了防止光损伤，高等植物进化出了各种保护机制（Bailey et al.，2004；DalCorso et al，2008）。这些方法包括及时清除活性氧以减轻活性氧对植物造成的光氧化破坏（Zheng et al.，2022），或由环式电子传递链生成ATP, 用于光系统损伤修复（Yamori et al.，2016）。在CET途径中，电子从Fd循环到Cytb6f复合物（Johnson，2011；Shikanai，2007），形成可以驱动ATP合成的跨膜质子梯度（Ruban et al.，2012）。如及时清除活性氧以减轻活性氧对植物造成的光氧化破坏。在本研究中，Fd（tr|I1GL62| I1GL62_BRADI）随着放牧强度的增加而增加，并在HG条件下显著增加（约为MG的1.56倍）。在HG条件下，Fd（tr|I1GL62）依赖的循环电子流高于MG和NG条件下。这表明说明重度放牧提高了Fd介导的环式电子流传递速率与能力，从而提高保护光合系反应中心的能力。短花针茅在放牧处理下会产生大量ROS，Fd参与的水-水循环是清除叶绿体ROS的有效途径（Liu et al，2019；Munekage et al，2002）。这些结果均反映出CET在防御胁迫引起的光破坏中发挥重要作用，满足植物在逆境条件下叶绿体对ATP的需求（Lehtimaki et al，2010；Makino et al，2002）。PSII修复、Fd介导的环式电子流、碳固定途径相关基因与蛋白表达相似的趋势，反映了这些光保护机制协同效应以减轻光抑制，从而保护光合作用，是短花针茅响应放牧的适应性策略。

光合作用中暗反应是利用光反应产生的 ATP 和NADPH，经过Calvin-Benson循环将CO₂和水转化成碳水化合物的过程，是由多种酶参与的复杂的酶促反应，如 RuBisco、脱氢酶和激酶等，各种酶的活性将影响CO2 固定进程。

在短花针茅中，rbcS（tr|M8AQ24，tr|M7YD23）在MG下上调，但在HG下显著下调（约为MG的0.5-0.7倍）。GAPDHase（tr|A0A446MF32）在MG下显著上调1.75倍，而在HG下显著下调（约为MG的0.46倍）。在大针茅中，RuBisCo和GAPDHase的编码基因在MG和HG条件下均高表达，与MG相比，在HG条件下导致超补偿生长和光合能力增加（Dang et al.，2021）。同样，在MG条件下，短花针茅的RuBisCo和GAPDHase以及Pn的相对表达量均显著增加。这表明，蛋白质的相对表达通过增强光合作用来满足MG条件下生存的能量需求，直接影响了物种的光合过程。而在HG条件下，RuBisCo和GAPDHase的相对表达量与Pn指数无相关性。这可能是由于MG条件下叶片光合传递系统维持较好和正常代谢周期有关。随着放牧强度的增加，对光合系统的损伤程度加剧。这导致了光合代谢的抑制，从而导致RuBisCo和GAPDHase的表达发生了相应的变化。

结论

长期放牧导致分子表型可塑性，影响短花针茅的各种生物过程和代谢途径。在不同放牧强度条件下，共鉴定出558个DEGs和541个DEPs。它们主要与RNA的加工、碳代谢和次生代谢产物的生物合成有关。相关性分析显示，转录组与蛋白质组之间的相关性较低。这表明，在植物对放牧的反应过程中，基因表达在转录后和翻译水平上的大规模调控。参与光合作用和苯丙素代谢途径的关键基因和蛋白的表达谱表明，它们对放牧的协同响应。本研究加深了对草地植物放牧适应响应机制的认识，为长期放牧下的表型和分子适应提供了有价值的见解。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12071

引用格式：Liu, Y., Sun, S., Zhang, Y., Song, M., Tian, Y., Lockhart, P. J., Zhang, X., Xu, Y., & Dang, Z. (2024). Integrated transcriptome and proteome analyses reveal potential mechanisms in Stipa breviflora underlying adaptation to grazing. Grassland Research, 3(1), 1–17. https://doi.org/10.1002/glr2.12071

排版：张莉

统筹：秦泽平 沈锦慧

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