近日，《表型组学》（Phenomics）在线发表了复旦大学人类表型组研究院郑琰研究员和生命科学学院全哲学教授题为“Sample collection, DNA extraction, and library construction protocols of the human microbiome studies in the International Human Phenome Project”的研究论文。

该研究提供了针对包括鼻腔、口腔、皮肤以及粪便在内的人体微生物样本的样本采集、DNA提取和文库构建的详细操作方法，为人体微生物组研究提供了一套可重复的样品处理标准流程。

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原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s43657-023-00097-y

原文pdf链接：https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s43657-023-00097-y.pdf

DOI：https://doi.org/10.1007/s43657-023-00097-y

引用格式：Wang, Y., Zhang, R., Pu, Y. et al. Sample Collection, DNA Extraction, and Library Construction Protocols of the Human Microbiome Studies in the International Human Phenome Project. Phenomics (2023).

研究背景：

人体微生物组在人类健康中起着至关重要的作用，并且与人类健康表型直接相关。在过去的十年里，高通量测序技术的发展和相关分析软件的进步极大地提高了我们对人体微生物组的认识。然而，大多数有关人体微生物组的研究没有提供可重复的操作流程来指导样本的收集、处理和加工，这阻碍了微生物分类与功能结果的可重复性。因此，该研究根据“国际人类表型组计划（I期）”中健康成人参与者的鼻腔内表面、唾液、皮肤表层和粪便中的微生物样本，提出了样品采集、DNA提取和文库构建的标准操作流程，可用于人类鼻腔内表面、唾液和皮肤表层的微生物样本的扩增子测序，以及人类粪便样本的鸟枪法宏基因组测序。该项研究旨在制定实用的程序标准，以提高人类样本的微生物群分析的可重复性。

样本的采集和转移 

1. 鼻腔内表面和皮肤表层微生物样本的采集和转移

工作人员佩戴好手套及口罩，将无菌标本采集拭子，伸进一侧鼻孔约2.5厘米，与鼻黏膜接触，轻轻擦拭前鼻孔的黏膜表面，围绕该区域旋转2次（持续5秒）。将拭子头部插入冻存管中，并将拭子高于冻存管的部分折断。取新的无菌拭子，对另一侧鼻孔进行相同操作，两个拭子合并作为组合样本。两侧鼻孔均采样完毕后将采样管放入4 ^oC冰箱。

皮肤表层微生物样本的采集包括头皮、前臂、背部和额头四个部位，如图1所示。将采样拭子事先用无菌SCF-1溶液浸润，而后保持拭子轴平行于皮肤表面，并施加稳定的压力，前后摩擦约30-50次，持续约30秒进行采样，尽量保持所定面积均匀采样。将拭子头部插入冻存管中，并将拭子高于冻存管的部分折断，放入4 ^oC冰箱。

采集完一批样本后，将其转移到标准样本盒中，按照生物库管理的标准操作程序进行整理，最后将其储存在-80 ^oC冰箱。

图1 鼻腔和皮肤采样部位示意图

2. 唾液样本的采集和转移

受试者用舌头轻刮口腔两侧，将唾液沿管口吐入管内，直至唾液达到80%容量（不含泡沫）。采集完一批样本后，工作人员将每支采样管等分到两个冻存管中，然后，将其转移到标准样本盒，最后储存在-80 ^oC冰箱中。

3. 粪便样品的采集和转移

为受试者提供一个粪便采集工具包。受试者直接将粪便排入覆盖有粪便采集袋的纸碗中，确保没有尿液、水或其他物质进入碗中。拧开粪便采集管，使用管盖上的取样勺（或小木棒）挖取一勺中段粪样本（约大拇指指甲盖大小），将勺子连同粪便样本放回管中，并旋紧管盖。共需采集两管粪样，将两个采样管放入密封袋中，放入冰箱（上午5:30至下午4:50放入4 ^oC冰箱，下午4:50至5:30为-20 ^oC冰箱），并通知工作人员。工作人员在30分钟内将收集的样本等分到四个冻存管中，储存到-80 ^oC冰箱。

DNA提取和文库构建

1. 鼻腔内表面、皮肤表层和唾液样本的DNA提取以及扩增子测序

使用TissueLyser II组织研磨仪以及QIAcube HT核酸提取仪进行DNA提取。然后，对细菌16S rRNA基因V4区和真菌ITS1区进行扩增。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳纯化，并提取目标条带，用KAPA LTP 文库制备试剂盒和PKR Y Type Adapter试剂盒制备Illumina测序文库。最后，通过Illumina Novaseq 6000 PE250测序平台对扩增子进行测序。使用Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2（QIIME2）程序对扩增子序列进行分析。

2. 粪便样本的DNA提取和鸟枪法宏基因组测序

粪便样本的DNA提取与鼻腔和皮肤拭子以及唾液样本的提取一致。

鸟枪法宏基因组测序文库的制备是在Biomek i5自动工作站上利用DNA文库制备试剂盒进行的。首先，通过将Transposase Mix（含Tn5转座酶和等摩尔的Adapter 1和Adapter 2）与DNA样本在55^oC下孵育10分钟来进行DNA片段化和末端连接。得到的片段化产物经N5 (N5XX)和N7 (N7XX)引物扩增，扩增产物再进行长度分选和纯化后即得到所需的可测序DNA文库。使用Illumina Novaseq 6000 PE250测序平台进行鸟枪法宏基因组测序。

前期预实验

1. 采样拭子/胶带和扩增循环数的选择

在对四名受试者的预实验中，使用了四种用SCF-1溶液湿润的无菌采集拭子以及两种类型的采样胶带，从头皮、额头和前臂皮肤表面采集微生物组样本。在提取DNA后，目标DNA片段在30或35个PCR循环后被扩增。然而，一些受试者的目标条带在35个PCR循环后很弱（例如，图2a中受试者3和4的d和e列），而在30个PCR循环后甚至没有出现（例如，图2b中受试者3和4）。因此，在扩增过程中应用35个PCR循环。此外，由于利用胶带采样的方法需要更多的手工操作（更容易造成污染），而且其PCR产物表现也不太理想，所以选择了棉拭子而不是胶带进行采样。

图2 四名受试者通过35个循环（a）和30个循环（b）的PCR产物的琼脂糖凝胶泳图

2. 拭子湿润度的选择

在预实验中，应用了几种未经湿润的无菌采样拭子，从一名受试者的头皮、前额和前臂皮肤采集微生物组样本。琼脂糖凝胶上观察到的16S rRNA基因的所有PCR产物都没有目标条带，这表明有必要对拭子进行预湿润。然而，拭子中过高的溶液浓度也可能降低该过程的效率。因此，在将拭子的尖端浸入溶液后，还需将拭子粘在SCF-1溶液管的内壁上部，以挤出过多的溶液。

3. DNA提取方案的选择

在预实验中，应用了9种试剂盒从粪便、唾液和模拟微生物群落中提取DNA。其中，包含磁珠击打步骤的DNeasy PowerSoil HTP 96试剂盒在DNA产量、纯度、稳定性、阳性模拟群落对照的偏差、从革兰氏阳性细菌中提取DNA的效率以及使用匹配的自动提取仪将提取管道扩展到多种类型样品的能力方面表现最好。

4. PCR聚合酶的选择和污染的排查

在预实验中，用35个循环的PCR程序测试了三种常用的聚合酶试剂盒。对于VAHTS HiFi扩增DNA聚合酶，在扩增前臂皮肤样本时没有观察到目标条带，表明其扩增能力较弱。而对于KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶和Premix Ex Taq DNA聚合酶，测序数据分析显示它们在应用于皮肤微生物组样品时没有明显差异（图3）。

图3 额头皮肤样本（a，b）和前臂样本（c，d）由三种类型的PCR聚合酶扩增的前20个细菌类群的组成，barcode不同。a和c中的样本由诺禾致源公司测序，而b和d中的样本由金唯智公司测序

为了进一步检查KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶和Premix Ex Taq DNA聚合酶的试剂盒污染物，选择一株从马里亚纳海沟分离出来的Limimaricola属的菌株作为对照，用两种聚合酶进行了扩增。测序数据显示，在使用KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶试剂盒扩增的样品中，除了Limimaricola之外，其他细菌的比例高于使用Premix Ex Taq DNA聚合酶试剂盒的样品（图4）。这一结果表明，在KAPA HiFi HotStart DNA聚合酶试剂盒中存在较多的污染物。因此，Premix Ex Taq DNA聚合酶被选为16S扩增程序中合适的PCR酶试剂盒。

（不同公司试剂的比较分析结果只适用于所使用批次试剂，不同批次试剂需再次确认。）

图4 两种候选PCR聚合酶试剂盒对Limimaricola的稀释样品扩增的前20个细菌属的相对丰度

讨论

该项研究的目的是为未来的人体微生物组研究提供一个样本处理的标准流程，需要在实际操作过程中对上述程序标准进行持续更新和优化，以进一步减少实验差异，提高操作的稳定性和可预测性。

复旦大学人类表型组研究院郑琰研究员和生命科学学院全哲学教授为共同通讯作者，2021级硕士生王烨彤为第一作者。该研究得到了复旦大学生命科学学院和中山医院伦理委员会的批准，并按照《赫尔辛基宣言》的原则进行。每个志愿者在入组前都获得了其书面的知情同意书。该研究得到中国国家重点研发计划（2021YFA1301000）和上海市科技重大专项（2017SHZDZX01）的支持。

Abstract

The human microbiome plays a crucial role in human health. In the past decade, advances in high-throughput sequencing technologies and analytical software have significantly improved our knowledge of the human microbiome. However, most studies concerning the human microbiome did not provide repeatable protocols to guide the sample collection, handling, and processing procedures, which impedes obtaining valid and timely microbial taxonomic and functional results. This protocol provides detailed operation methods of human microbial sample collection, DNA extraction, and library construction for both the amplicon sequencing-based measurements of the microbial samples from the human nasal cavity, oral cavity, and skin, as well as the shotgun metagenomic sequencing-based measurements of the human stool samples among adult participants. This study intends to develop practical procedure standards to improve the reproducibility of microbiota profiling of human samples.

通讯作者：郑琰

郑琰，复旦大学生命科学学院/人类表型组研究院研究员。2008-2010年就读于美国Emory大学并获公共卫生硕士学位，2010-2013年就读于美国德州大学公共卫生学院并获流行病学博士学位。2014-2017在美国哈佛大学陈曾熙公共卫生学院从事博士后研究。主要研究方向为肥胖相关代谢病的人群流行病学因素，尤其是利用代谢组及微生物组学大数据，发现肥胖相关疾病的新型生物标志物，探索饮食影响健康的代谢中介机制。迄今已发表SCI收录论文90余篇，以重要作者身份在JAMA、Nature Reviews Endocrinology、BMJ、Diabetes Care、National Science Review等杂志上发表文章46篇，多篇入选ESI高被引论文并受到国内外媒体报道。获国家“万人计划”青年拔尖人才和上海市东方学者等项目支持，目前主持国家级课题2项并参与1项。主要学术兼职包括：Molecular Genetics and Genomics杂志副主编、中国营养学会营养流行病分会/基础营养学分会委员和中国老年学和老年医学学会委员。

通讯作者：全哲学

全哲学，复旦大学生命科学学院教授。在北京大学化学系获学士学位，在韩国科学技术院生物科学系获博士学位。SCI杂志PLoS ONE和Journal of Microbiology的编委，Frontiers in Microbiology的审稿编委；中国微生物学会教学工作委员会委员；国家自然科学基金委重大研究项目“水圈微生物驱动地球元素循环的机制”专家组学术秘书。主要研究方向为人体皮肤微生物组和硝化微生物的生态机制等。

第一作者：王烨彤

王烨彤，复旦大学人类表型组研究院，硕士生。2021年本科毕业于江南大学，同年入复旦大学攻读研究生。2023年，在Phenomics期刊以第一作者发表研究论文。

Phenomics期刊简介

Phenomics是一本新创的同行评审国际期刊，聚焦表型组学前沿研究，搭建全球表型组学领域专家交流的国际平台，推动该领域相关的理论创新和学科发展。

本期刊拥有强大的国际编委团队，复旦大学金力院士担任主编，美国系统生物学研究所Leroy Hood院士、澳大利亚莫道克大学Jeremy Nicholson院士、德国莱布尼兹环境医学研究所Jean Krutmann院士、复旦大学唐惠儒教授共同担任副主编，复旦大学丁琛教授担任执行主编，另有来自全球多国的三十多位著名科学家共同组成编委团队，以及四十多位青年科学家组成青年编委团队。

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