本文介绍的是华中科技大学张智红教授及祁淑红副研究员课题组通过构建稳定表达荧光蛋白的小鼠胶质瘤细胞株结合多色荧光标记技术，可视化胶质瘤微环境的研究，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第1期。

Fluorescence imaging analysis of the glioma microenvironment

荧光成像分析胶质瘤微环境

Xuwen Peng, Yuzhou Chen, Yuke Wang and Shuhong Qi

研究背景

胶质瘤是最具侵略性的恶性肿瘤之一，生存率低，复发率高。胶质瘤的微环境组成很复杂，包括神经元、微血管、星形胶质细胞和各种免疫细胞，如小胶质细胞、单核-巨噬细胞和T淋巴细胞。这些细胞在胶质瘤侵袭和转移的过程中发挥着重要作用，而它们在胶质瘤微环境中的准确空间分布及其与胶质瘤转移的关系尚不清楚。因此，本文结合多色免疫荧光标记以及共聚焦成像技术，探索了小鼠原位胶质瘤以及转移灶中神经元以及多种关键免疫细胞的空间分布。

内容简介

本文筛选了一株稳定表达大斯托克斯位移的黄色荧光蛋白mAmetrine的小鼠胶质瘤细胞株，并将其应用于多色免疫荧光成像。结合多色免疫荧光和共聚焦成像技术，可视化研究神经元、小胶质细胞、单核-巨噬细胞和T细胞在mAmetrine-GL261小鼠胶质瘤微环境和转移灶的空间分布。神经元在胶质瘤核心部位分布稀少，且单核-巨噬细胞和小胶质细胞的空间分布具有较大异质性。胶质瘤细胞具有沿血管外壁向外浸润性生长的特点，转移灶招募了大量的单核-巨噬细胞和T细胞。这些发现为研究胶质瘤的侵袭性生长和转移提供了新的视角，并有助于通过针对胶质瘤中的免疫调节细胞设计新的免疫治疗策略。

图文导读

1.筛选稳定表达荧光蛋白mAmetrine的GL261小鼠胶质瘤细胞株

图1：mAmetrine-GL261细胞的检测。(a) mAemtrine-GL261细胞的代表性共聚焦图像。(b) 11张图像中荧光和非荧光细胞的统计。(c) GL261和mAmetrine-GL261的中位荧光强度

通过PB转座子系统将编码大斯托克斯移位的黄色荧光蛋白mAmetrine（激发/发射：406 nm/526 nm）的质粒转染至GL261小鼠胶质瘤细胞中，以获取mAmetrine-GL261细胞株。根据激光共聚焦成像及流式结果，具有mAmetrine荧光的GL261细胞比例超过95%，且mAmetrine-GL261细胞的中位荧光强度比GL261细胞高1321倍（图1（a）-（c））。因此，可以确定该筛选得到的mAmetrine-GL261细胞株稳定表达荧光蛋白mAmetrine。

2.mAmetrine-GL261细胞株的成瘤性检测

图2：mAmetine-GL261细胞植入小鼠大脑后第25天鼠脑切片的染色结果。(a) 小鼠大脑表面实物图，比例尺为1cm。(b) 小鼠大脑内部的EvansBlue染色，比例尺为1cm。(c) 全脑的H&E染色结果，比例尺为500μm。(d) 胶质瘤核心区域，比例尺为50μm。(e) 胶质瘤边缘区域，白色箭头表示浸润的胶质瘤细胞，比例尺为50μm

为了确定筛选出的mAmetrine-GL261小鼠胶质瘤细胞株的成瘤性，在C57BL/6小鼠颅内纹状体位置接种mAmetrine-GL261细胞，荷瘤生长25天。如图2（a）-（b），EvansBlue染色结果显示，鼠脑内部存在蓝色染色区域即为胶质瘤生长区域，且肿瘤还未生长至鼠脑表面；图2（c）-（e）呈现了鼠脑切片的H&E染色结果，表明mAmetrine-GL261胶质瘤细胞确实成为肿瘤组织。胶质瘤生长存在核心部位密集生长（图2（d）），边缘部位浸润性生长的特征（图2（e）中白色箭头）。

3.小鼠胶质瘤微环境中神经元的免疫荧光成像

图3：植入mAmetrine-GL261后第25天的鼠脑切片免疫荧光成像结果。(a) 大视野成像图，比例尺为500 μm。(b) 胶质瘤核心区域的神经元分布成像图，比例尺为50 μm。(c)胶质瘤边缘区域的神经元分布成像图，比例尺为50 μm。白色箭头指示胶质瘤浸润生长的单个细胞，比例尺为50 μm。(d)对侧脑区、胶质瘤边缘和胶质瘤核心的成像图，比例尺为500 μm。(e) 对侧脑区（n=10个视野）、胶质瘤边缘（n=12个视野）和胶质瘤核心（n=9个视野）的神经元密度定量分析结果

共聚焦成像结果显示，神经元稀疏地分布在胶质瘤核心区（图3（a）-（b）），在胶质瘤边缘区域，神经元沿着胶质瘤周围分布（图3（c）），而神经元在正常大脑部位（对侧脑区）密集分布（图3（d））。定量数据表明，与对侧脑区和胶质瘤边缘相比，肿瘤核心的神经元平均密度分别下降了90%和50%（图3（e）），该结果表明胶质瘤在大脑中的生长会导致胶质瘤区域内的神经元数量急剧减少。

4.小鼠胶质瘤微环境中免疫细胞的多色免疫荧光成像

图4：胶质瘤微环境的多色免疫荧光成像以及对胶质瘤微环境中各免疫细胞的浸润密度和分布的定量分析。(a) 大视野图像，比例尺为500 μm。(b) 胶质瘤核心的代表性共聚焦显微镜图像，比例尺为50 μm。(c) 胶质瘤边缘的代表性共聚焦显微镜图像，白色箭头表示小胶质细胞，比例尺为50 μm。(d-e)胶质瘤核心、胶质瘤边缘和正常大脑部位的单核-巨噬细胞、小胶质细胞和T细胞密度

为了量化胶质瘤微环境中免疫细胞的浸润程度和空间分布，通过多色免疫荧光标记多种免疫细胞来观察胶质瘤微环境，并量化每个成像区域中浸润的单核-巨噬细胞、小胶质细胞和T细胞的数量，如白框所示（图4（a）-（c））。与对侧脑区和胶质瘤边缘相比，单核-巨噬细胞的密度在胶质瘤核心分别高出116倍和6倍（图4（d））。这表明在胶质瘤生长过程中，单核细胞-巨噬细胞被大量招募到胶质瘤内部。这三个区域的小胶质细胞数量没有明显差异，说明胶质瘤的生长对小胶质细胞在大脑中的分布没有明显影响（图4（e））。此外，在胶质瘤周围，小胶质细胞紧密地围绕着浸润生长的胶质瘤细胞，推测是小胶质细胞和胶质瘤细胞之间存在相互作用（图4（c））。CD3+T细胞的浸润与单核细胞-巨噬细胞的浸润相似。与正常大脑部位和胶质瘤边缘相比，胶质瘤内部的T细胞密度分别高出30倍和1.8倍（图4（f））。综上所述，胶质瘤微环境中单核-巨噬细胞、小胶质细胞和T细胞的分布具有空间异质性。

5.小鼠胶质瘤转移灶中单核-巨噬细胞和T细胞的多色免疫荧光成像

图5：胶质瘤转移灶的多色免疫荧光成像以及对各种免疫细胞的浸润密度和分布的定量分析。(a)原位胶质瘤和转移灶中单核-巨噬细胞和T细胞的大视野图像，比例尺为500μm。(b)-(d) T细胞和单核-巨噬细胞在转移灶中的浸润，白色箭头表示单个胶质瘤细胞，比例尺为50 μm。(e)-(f) 原位胶质瘤和转移灶中的T细胞和单核-巨噬细胞密度的定量分析

为了研究免疫细胞在胶质瘤转移灶中的分布，本文对小鼠胶质瘤转移灶进行多色免疫荧光成像（图5（a）），观察到在脑部的多个区域都存在有被单核-巨噬细胞紧密包围的单个胶质瘤细胞，如白色箭头所示（图5（b）-（d））。此外，胶质瘤细胞具有沿血管外壁向外侵袭并生长的特征，胶质瘤细胞紧密地附着在血管外壁上（图5（b）-（d））。定量数据表明，胶质瘤转移灶内的T细胞和单核-巨噬细胞密度分别比原位胶质瘤核心区域的密度高约1.5倍和1.7倍（图5（e）-（f））。上述结果表明，大量的单核-巨噬细胞和T细胞被招募到转移灶中，这进一步促进了胶质瘤的侵袭和转移。

通讯作者简介

祁淑红，现任华中科技大学武汉光电国家研究中心副研究员，国际光学工程学会会员、中国免疫学会会员、中国光学学会会员、中国抗癌协会会员。主要从事肿瘤免疫治疗的活体光学成像研究，利用活体光学成像技术对肿瘤免疫治疗过程中肿瘤微环境的多种免疫细胞的运动行为进行可视化研究，揭示多种免疫细胞在肿瘤免疫治疗过程中的关键作用和相关机制，以第一作者/通讯作者在eLife, Theranostics, Biomaterials, Nanophotonics等国际重要期刊上发表高水平论文十余篇。研究兴趣聚焦于脑胶质瘤免疫治疗的活体可视化研究，肿瘤细胞多种死亡方式及免疫微环境变化的活体可视化研究等。