本文介绍的是华中科技大学光学与电子信息学院费鹏教授课题组对光场显微成像技术极其生物成像应用进行的系统性综述，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第1期。

Light field microscopy in biological imaging

光场显微技术的生物应用

Chengqiang Yi, Lanxin Zhu, Dongyu Li and Peng Fei

研究背景

光场显微镜（lightfield microscopy, LFM）技术利用微透镜阵列的周期性调制，将三维空间信息编码进二维图像，进而通过解码，重建三维信息。相比于传统基于扫描的三维成像技术，LFM一次曝光即可获得三维图像，因而具备极高的体积成像速度，并被广泛应用于各类生命活动的观测中，比如心脏跳动，血液循环，细胞成像等。近年来，研究人员不断提出新的光路设计和重建算法，进一步提高光场成像的空间分辨率、重建深度和视场范围，以应对更多的生物应用场景。

内容简介

本文对光场显微成像技术的发展及生物应用进行了系统性综述，主要包括传统光场显微成像技术及其光学改进、包括深度学习在内的各类重建算法、以及光场显微成像技术的不同应用场景。这些研究对于提升光场成像技术的性能，扩展其在科学研究中的应用具有重要意义，为高速三维观测微观生命活动提供了重要工具。

图文导读

1.光场显微技术及其光学改进

图1：光场显微技术原理。(a)四维光场采集(b)基于几何模型的重聚焦算法 (c)基于波动光学的反卷积算法

光场显微技术利用微透镜阵列对在三维空间分布的入射光线进行编码调制，实现角度信息与空间信息的同时采集，通过后期重建算法，例如光线重聚焦(图1b)，反卷积算法(图1c)，获得原始物方空间的三维信号分布。由于显微系统固有的衍射效应，后者的重建分辨率以及有效重建深度皆优于基于几何光学的重建算法。

图2：不同模态下的光场显微镜。(a)传统光场显微镜。通过插入的微透镜阵列使得探测器能够同时捕捉到三维样本的二维空间信息和二维角度信息(b)基于扫描的光场显微技术。(c)双视角光场探测光路。 (d)傅里叶光场显微技术。(e)景深扩展的傅里叶光场显微镜。(f)共聚焦傅里叶光场显微镜

由于传统的光场显微成像技术（图2a）存在空间分辨率低，轴向采样不均匀的弊端，其三维重建结果无法满足对分辨率要求较高的应用，并且其焦面处的重建伪影极大地影响了重建质量。研究人员在光路设计上不断改进，提出了多种显微光场光路以解决传统光场显微技术的不同弊端。比如，利用高速振镜进行周期扫描可以克服欠采样导致的重建分辨率低的问题（图2b）；双视角光场探测可显著提高重建的轴向分辨率，达到近乎各向同性的空间分辨率（图2c）；傅里叶光场成像技术将微透镜阵列放置于光路的傅里叶平面，从而直接探测样本的不同视角图像，消除了采样混叠的影响（图2d）；采用两组不同焦距的微透镜形成混合微透镜阵列可实现景深扩展（图2e）；结合共聚焦探测设置能够去除大量离焦背景散射光，实现在厚样本成像时的低信噪比/信背比光场图像的三维重建（图2f）。

2.基于深度学习的光场显微技术

基于反卷积的重建算法无法克服焦面的伪影，而且没有考虑噪声以及散射背景的干扰，限制了重建质量。近年来，深度学习技术在处理荧光图像任务中，例如图像超分辨，图像去噪等相较于传统算法在性能以及运算速度上取得明显优势。深度学习的数据先验带来的性能提升这一特性对于光场三维重建亦有帮助。

目前基于深度学习的光场三维重建算法主要分为以下两种:

（a）基于模拟数据的网络构建

如图3(a)所示，利用基于波动光学的光场成像仿真模型，对外源高分辨三维数据进行模拟投影，形成"高分辨三维图像-低分辨率二维光场图像"的数据对，建立"视角-通道-深度"转换网络，逐步将光场图像中的多视角信息转化为三维图像堆栈。经过大量数据训练后，该网络能够实现高分辨的快速重建光场时间序列，克服了传统反卷积算法分辨率低，重建伪影大，运算速度慢的缺点。

（b）基于实测数据的网络构建：

如图3(b)所示，该方法需建立"光场-光片"原位系统，通过图像校准等操作实现扫描三维图像与采集二维光场图像的配对。该方法特点在于可以对高速运动样本的光场-光片数据实现连续训练/验证，有助于提升重建结果的保真度。

图3:基于深度学习的光场三维重建算法 (a) VCD网络构建流程：(b) HyLFM-Net重建流程：不同于VCD基于模拟数据的训练流程，该方法基于光场-光片的原位系统，训练数据来自于实际采集到的二维光场图像以及扫描得到的三维图像

3.光场显微成像技术的生物应用

图4:光场显微镜在生物应用中的多尺度成像。(a)和(b)为亚细胞成像。(a)为HR-FLFM对COS-7细胞的三维重建结果的最大强度投影。(b)迁移体在血管中的形成 (c)~(h)光场显微镜在模式生物中的成像应用。(c)线虫运动神经元活动追踪。(d)红细胞重建结果。左：xy最大强度投影；右：yz最大强度投影。(e)心脏收缩时红细胞的速率分布。(f)鼠脑中神经细胞活动记录及其分析。(g)鼠脑血管中的红细胞成像

目前光场成像技术凭借其高速的三维成像能力，已在多种生物样本成像中得到应用，例如活细胞成像，多尺度的模式生物成像。

由于光场单帧重建三维以及高光子利用率的特点，适合对成像速率以及光毒性有要求的活细胞成像。如图4所示，（a）与（b）分别展示了利用傅里叶光场显微镜以及扫描空间显微镜的亚细胞成像结果，该结果展示了细胞中细胞器的高速互作，对于研究细胞调控机制及其相关疾病有重要作用。

除了亚细胞尺度的三维动态过程，在细胞乃至组织层面也存在多种复杂三维瞬态生物过程，例如心跳，血流，神经闪烁等。 如图4(c)~(g)所示，展现了利用光场显微技术对模式生物，例如线虫，小鼠，斑马鱼的成像应用，成功的对神经元强度，血流速度，心脏跳动等重要生物过程进行高时空分辨率的长时程观察与分析。

通讯作者简介

费鹏,华中科技大学光电学院教授，华中科技大学附属武汉同济医院兼职教授；主持国家杰出青年科学基金，曾入选国家海外高层次青年人才；承担国家863计划、国家重点研发计划、基金委重大仪器研制等多项国家级项目。课题组聚焦于计算光学显微成像新原理、新方法、新仪器的研究，并致力于开拓它们在生物医学中的新应用。在Nature Methods (2), Nature Materials, Nature Communications，PNAS, Optica等高水平期刊发表论文70余篇，授权发明专利/软件著作权30余项，多项专利实现产业转化。现任SPIE Journal of Biomedical Optics期刊Associate Editor。

李东宇,华中科技大学光学与电子信息学院副教授。长期从事光学成像技术及应用研究，包括非线性光学成像、组织光透明成像、超分辨成像等。以第一或通讯作者在Light: Science & Applications、Advanced Materials、Nano Today等 期刊发表SCI论文18篇。获得国家自然科学基金青年基金、中国博士后创新人才支持计划等多项国家及省部级资助。