原文出自 Agronomy 期刊

Liu, Z.; Cao, X.; Yu, C.; Yuan, X. Probing the RNA Structure of a Satellite RNA of Cucumber Mosaic Virus Using SHAPE Method. Agronomy 2023, 13, 1990. https://doi.org/10.3390/agronomy13081990

作者介绍

通讯作者：原雪峰，理学博士、教授、博士生导师，山东农业大学“1512 工程”第二层次。现任山东农业大学植物保护学院院长、山东省烟草产业技术体系副首席专家。Agronomy 客座编辑，Frontier in Microbiology、Viruses 等期刊审稿专家。先后主持国家自然科学基金面上项目 5 项、山东省重点研发计划等 10 项项目。长期从事植物 RNA 病毒的分子进化与基因表达调控机理研究，在 Nucleic Acids Research、RNA、Plant Biotechnology Journal、Journal of Virology 等期刊发表论文 60 余篇；其中第一或通讯作者发表 42 篇，单篇最高影响因子 16.97，单篇最高引用 78 次；第一发明人授权国家发明专利 7 项、澳大利亚专利 1 项。全国大学生植保能力大赛团体二等奖指导教师、山东省优秀博士学位论文指导教师、山东省研究生优秀成果奖三等奖指导教师。

文章导读

RNA 结构的研究有助于理解特定 RNA 在生物学功能方面的表现。深入理解 RNA 结构的重要性不言而喻。虽然可以通过计算方法预测 RNA 结构，但基于序列的预测受到多种因素的制约，特别是在预测重要的短 RNA 结构时准确率较低。准确解析 RNA 二级三级结构必须通过试验方法获得，其中，Selective 2’-hydroxylacylation analyzed by primer extension (SHAPE) 技术是一种经典的 RNA 结构分析方法，可以准确获得 RNA 结构，用于其功能性分析。

病毒基因的复制涉及转录和翻译等关键过程，其中 RNA 结构中的高级结构起着重要作用。一些病毒伴随有卫星 RNA，这些卫星 RNA 通过核心作用元件调控辅助病毒的致病能力。因此，正确解析卫星 RNA 结构对于揭示卫星 RNA 如何调控辅助病毒的复制机制至关重要。

山东农业大学植物保护学院的原雪峰教授及其团队在 Agronomy 期刊上发表了研究论文，通过优化 SHAPE 技术体系，解决了 SHAPE 反应中出现阴性对照强条带的情况，为解析短链 RNA 结构提供了改进方法。通过优化后的 SHAPE 方法，分析了 CMV 病毒的致弱卫星 satCMV TA-Tb 的 RNA 结构，为深入研究卫星 RNA 降低辅助病毒的致病力提供结构基础。

研究过程与结果

根据 Nature Protocol 方案中，使用 1.0 pmol RNA 模板量来进行 satCMV TA-Tb 的 SHAPE 反应，结果发现，(-) NMIA 和 (+) NMIA 两个泳道中都无法检测到反应信号 (图 1A)。将 RNA 模板量提高到 10.0 pmol，能够探测到反应信号，但在 (-) NMIA 泳道中出现了许多强背景信号的条带 (图 1B)，无法进行结构解析。通过调整一系列反应条件，如提高退火温度、更换溶剂等，改进措施没有减少 (-) NMIA 泳道中的强背景信号。随后，我们尝试调整模板量至 2.0 pmol，发现 (-) NMIA 泳道中的条带信号变弱，同时在 (+) NMIA 泳道中清晰地观察到 SHAPE 反应的终止信号 (图 1C\D)。这表明在自身易形成稳定结构的短 RNA 结构解析时，适宜的 RNA 模板量是至关重要的。

图 1. satCMV TA-Tb SHAPE 反应最适模板用量优化探索

通过成功构建的 SHAPE 技术体系，将 CMV 致弱型卫星 RNA 进行结构解析 (图 2A)。结合 mfold 软件预测与 SHAPE 分析结果绘制出卫星全长结构，结果显示 satCMV TA-Tb 结构包括近 6 个茎环结构 (图 2B)，其中包括 5’和 3’茎环 (SL1，SL2，SL4，SL5，SL6) 和一个多分枝茎环 (mbSL3)。另外，碱基互补配对分析发现 hL1 与 hL6、hL1 与 hL3-3 之间可能存在 kL1 和 kL2 两处 kissing loop。正确解析的 satCMV TA-Tb 二级、三级结构为其如何调控 CMV 的致病力提供了结构基础。

图 2. 基于优化的 SHAPE 方法解析卫星 CMV TA-Tb 全长结构

将已经发表的 CMV 卫星 RNA (332-405 nt) 构建系统发育树 (ML 法)，结果显示卫星 RNA 分为组 I 和组 II，其中 satCMV TA-Tb 属于组 II，该组中均是相对长链卫星 RNA (380-390 nt) (图 3A)。将组 II 中代表卫星 RNA 序列比对分析发现，虽然碱基序列有差异，但其高级结构具有相对保守性 (图 3B)。

图 3. satCMV 系统进化树及 RNA 结构保守性分析

研究总结

SHAPE 是一种广泛使用的 RNA 结构分析技术，研究发现，通过优化反应中模板 RNA 用量，可有效降低 DMSO 处理泳道中大量非特异性背景信号，从而成功构建了可用于解析短链 RNA 的 SHAPE 技术体系，并利用该体系获得了准确的 satCMV TA-Tb 结构解析。satCMV TA-Tb 全长 RNA 结构包含 5 个茎环和 1 个内部多分枝大茎环，其中 145-200 nt 位置为单链 hairpin Loop 区，是潜在的结构元件和互作位点。与卫星 satCMV TA-Tb 在系统发育上相近的其他 CMV 卫星中，5’端和 3’端茎环结构相对保守，推测该位置是卫星存活的关键区域。总之，本研究提出了基于解析病毒卫星 RNA 结构的 SHAPE 技术优化体系，首次解析了致弱型 satCMV TA-Tb 全长结构，为进一步阐明致弱型卫星 RNA 调控辅助病毒致病力提供了结构基础。

Agronomy 期刊介绍

主编：Peter Langridge, University of Adelaide, Australia

文章类型包括农学及农业生态学领域的研究型文章及综述，目前已被 Science Citation Index Expanded (SCIE) 和 Scopus 等多个数据库收录。在 2022 年中国科学院文献情报中心期刊分区 (升级版) 中位于农林科学 2 区。

2022 Impact Factor：3.7

2022 CiteScore：5.2

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Time to Publication：37 Days