原文出自  Metabolites  期刊

Cheng, M.; Shao, Z.; Wang, X.; Lu, C.; Li, S.; Duan, D. Novel Chitin Deacetylase from Thalassiosira weissflogii Highlights the Potential for Chitin Derivative Production. Metabolites 2023, 13, 429. https://doi.org/10.3390/metabo13030429

文章导读

硅藻是海洋初级生产力的主要贡献者，甲壳素 (几丁质) 是硅藻重要的碳积累产物，也是海洋中丰度最高的含氮多糖。硅藻源甲壳素为自然界存在较少的 β 型，与 α-甲壳素相比，β-甲壳素分子间相互作用较弱，因此更容易用来合成高附加值衍生物，如壳聚糖和壳寡糖，二者在生物医学及工业生产领域已被广泛应用。目前甲壳素衍生物多依赖于化学法制备，虽然酶法制备壳聚糖和壳寡糖的研究已有报道，但很少有从 β 型甲壳素的天然生产者中挖掘生物酶的研究。

中国科学院海洋研究所海藻遗传与发育团队近日在 Metabolites 期刊上发表的文章，从高产 β-甲壳素的硅藻威氏海链藻 (Thalassiosira weissflogii) 中鉴定并克隆了几丁质脱乙酰酶 (CDA) 基因，并对其结构和酶学性质进行了研究，最终获得一种能催化甲壳素和甲壳素低聚糖脱乙酰和降解的高效酶。相关结果为研究硅藻中甲壳素代谢的内在调控机制奠定了基础，也为壳聚糖及壳寡糖的绿色工业化制备提供了一种潜在的新型生物酶。

研究过程与结果

作者首先从海洋微生物真核生物转录组测序项目 (Marine Microbial Eukaryote Transcriptome Sequencing Project, MMETSP) 数据库中检索到几丁质脱乙酰酶序列 (TwCDA)，以威氏海链藻 cDNA 为模板克隆获得了具有全长 ORF 的 TwCDA，其在 44-393 氨基酸处有 8 个跨膜螺旋和一个信号锚定区 (图 1A)，在 C 端有完整的多糖脱乙酰酶 (Polysaccharide Deacetylase) 的特征结构域 (图 1C)。TwCDA 三级结构建模发现了一个单一结构域残基 (403-651)，具有典型的 (α/β)₈ 桶状折叠结构，这是所有 CE4 酯酶中存在的 NodB 同源结构域的共同特征 (图 1D)。同时，为保证后续重组蛋白表达丰度，作者去除 N 端跨膜结构后获得 TwCDA-S 序列，使其在 7~29 个氨基酸处仅保留 1 个跨膜螺旋 (图 1B)。

图 1. TwCDA 和 TwCDA-S 的序列比较。(A) TwCDA 的跨膜螺旋结构；(B) TwCDA-S 的跨膜螺旋结构；(C) TwCDA 和 TwCDA-S 的序列结构；(D) TwCDA 的三级结构：TwCDA 的立体图像和在 Tiny-TIM 中观察到的典型 TIM (α/β)₈ 桶状结构。

随后，作者将 TwCDAs 基因异源转化 E. coli 后，诱导重组蛋白表达，并对重组酶的几丁质脱乙酰活性进行了检测。分别以 β-甲壳素和 (GlcNAc)₅ 为底物，经过 TwCDA 和 TwCDA-S 充分催化反应后，使用 HPLC 和 GC-MS 检测底物中乙酸的生成。结果显示，TwCDA 可以催化 β-甲壳素及 (GlcNAc)₅ 的脱乙酰 (图 2A, B)，对五聚体的催化效率比对聚合物的催化效率高 1.20 倍。相比之下，TwCDA-S 不能催化 β-甲壳素脱乙酰 (图 2C, D)，对 (GlcNAc)5 寡糖的脱乙酰酶活性仅为 TwCDA 的 62.89%。

图 2. TwCDAs 对 β-甲壳素和五聚物寡糖 (GlcNAc)₅ 的脱乙酰反应色谱图。(A)：TwCDA 对 (GlcNAc)5 底物的脱乙酰作用；(B)：TwCDA 对 β-甲壳素底物的脱乙酰作用；(C)：TwCDA-S 对 (GlcNAc)5 的脱乙酰作用；(D)：TwCDA-S 对 β-甲壳素的脱乙酰作用。

目前已有的报道发现，某些几丁质脱乙酰酶同时还具有降解甲壳素糖链的活性，因此，作者使用 DNS 显色法对 TwCDAs 的断糖链活性进行了检测。实验结果表明，无论是以五聚体 (GlcNAc)₅ 还是以 β-甲壳素为底物，TwCDA 和 TwCDA-S 的反应体系中均检测到了还原糖的产生；去掉跨膜螺旋结构的 TwCDA-S 具有较高的断糖链活性，且在以 (GlcNAc)₅ 为底物时活性更高 (图 3A)。进一步探究 TwCDA-S 的最佳反应温度，结果表明在 20 ℃~45 ℃ 范围内，TwCDA-S 对 (GlcNAc)₅ 断糖链活性的最适温度为 35 ℃ (图 3B)。

图 3. TwCDAs 的甲壳素降解活性。(A)：以 β-甲壳素及 (GlcNAc)₅ 为底物时的酶活；(B)：以 (GlcNAc)₅ 为底物时不同温度 (20~45 ℃) 下的 TwCDA-S 断糖链活性。

研究总结

本研究对来自威氏海链藻 (Thalassiosira weissflogii) 的几丁质脱乙酰酶 (TwCDA) 进行了体外异源表达和功能分析。结果表明，几丁质脱乙酰酶全长序列 (TwCDA) 和 N 端截断序列 (TwCDA-S) 在大肠杆菌中表达后同时具有几丁质脱乙酰酶和几丁质酶活性。TwCDA 和 TwCDA-S 均能催化低聚糖 (GlcNAc)₅ 的脱乙酰作用。与 TwCDA-S 相比，TwCDA 具有较高的脱乙酰酶活性，并能催化 β-甲壳素聚合物的脱乙酰作用。TwCDA-S 对 (GlcNAc)₅ 有较高的甲壳素降解活性，最佳反应温度为 35 ℃。相关结果为硅藻甲壳素代谢的调控机理研究打下基础，也为高活性甲壳素衍生物的制备提供了一种潜在的海洋源新型生物酶资源。

Metabolites 期刊介绍

主编：Markus R. Meyer, Saarland University, Germany

期刊发表与代谢组学、代谢生物化学、计算和系统生物学、生物技术和医学领域相关的代谢物以及代谢方面的原创研究文章与评论文章。

2021 Impact Factor：5.581

2021 CiteScore：4.7

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Time to Publication：38 Days