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基因编辑在园艺作物改良中已获得多个成功范例，包括增强作物抗生物/非生物胁迫的能力，改变开花和果实成熟时间、生长特征、果实风味和果实色泽等 (如下图)。CRISPR/Csa9系统可同时编辑多个性状相关基因、缩短育种周期等。然而，园艺作物中基因编辑仍存在诸多限制，包括果树较长的童期、多倍性、纯合系获得难度大等。近期，发表于Horticulturae 期刊的一篇综述论文，概述了基于CRISPR/Cas的基因编辑在园艺作物改良育种中的最新研究进展及发展前景。

基因编辑在园艺作物中的应用年代表。

研究内容

提升蔬菜、果树及浆果类作物的产量及抗性，是现代农业和园艺产业迫切需要解决的问题。传统育种方法常需较长的育种周期，以基因编辑为代表的新育种方法正发挥越来越大的作用。在发展早期，基因编辑借助于TALEN、ZNFs和巨核酸酶等。随着操作简便、重复性高、成本低的CRISPR/Cas9系统的发现，基于CRISPR/Cas的基因编辑应用范围迅速扩大。基因编辑在改良作物抗生物/非生物胁迫的能力、开花和果实成熟时间、生长特性、果实风味和色泽等方面具有极大的潜能 (如下图)，已经在多种园艺作物中取得了成功 (详见原文表1和表2)。

基因编辑对园艺作物性状改良的应用潜能。

将CRISPR/Cas系统传递到植物细胞的常用方法是将其搭载到双元表达载体上，利用农杆菌介导的遗传转化或基因枪将重组表达载体转化到植物细胞中，或借助RNPs、PEG、电穿孔方法转染原生质体/外植体。在多数重组表达载体中，Cas核苷酸酶编码基因及sgRNA序列常由组成型启动子驱动，包括花椰菜病毒35S RNA启动子、泛素基因或RNA聚合酶III的U6、U3启动子。然而，Cas核苷酸酶在被转化植物的所有发育阶段持续表达，可发生错误的基因编辑，导致嵌合体或双等位基因株系发生的频率增加，而获得纯合体的难度同步增加。综合利用瞬时和稳定两个表达载体进行基因编辑，可在一定程度上规避上述缺陷：瞬时表达载体搭载Cas基因，稳定表达载体搭载sgRNA。但是瞬时表达体系的基因编辑效率却低得多，可考虑选择被转化植物的基因启动子，或者诱导型启动子驱动sgRNA和Cas的表达。

在部分优化试验条件的研究中发现，影响葡萄基因编辑精准度的主要因素是sgRNA中GC含量，而非Cas9的表达量。基因编辑中用于设计sgRNA的在线程序有多个，近期更新的CROPSR可在全基因组范围内设计并评估sgRNA质量，对果树等多倍体作物的基因组以及富含A/T的基因区域效果显著，提高了CRISPR/Cas系统基因编辑的效率。

Cas9核苷酸酶编辑基因的机制主要类似于indel突变，因此仅可编辑靶向的基因。而且Cas9核苷酸酶对PAM序列的依赖性极高，有时甚至无法编辑某些基因。针对这一缺陷，研究人员研发了修饰后对PAM序列依赖性降低的核苷酸酶，例如Cas9-NG、xCas9和SpRY等。此外，包括Cas12a (Cpf1) 和Cas13在内的核苷酸酶也逐步在基因编辑中得以应用。不过它们的基因编辑精准度常因物种基因型的变化而不同。

除CRISPR/Cas系统外，CRISPR-Act3.0和CRISPR-Combo等基因编辑体系被研发出，可在编辑基因的同时激活其他靶标基因的转录水平。拟南芥、杨树、水稻、番茄和梨的研究证实，新的体系可提高基因编辑效率，同时还加速了编辑植株的再生、繁殖和开花等进程。

尽管基因编辑在园艺作物改良中尚存在诸多限制，但随着体系的不断更新，其应用潜能仍十分强劲。下文列出了基因编辑对园艺作物改良的部分代表性案例：

· 提升园艺作物抗生物/非生物胁迫的能力

利用CRISPR/Cas9技术培育了抗内源性香蕉条纹病毒的香蕉突变体。突变体整合了病毒元件，使得内源性病毒蛋白无法转录和翻译。

· 改变果树的农艺性状

利用CRISPR/Cas9技术编辑香蕉中赤霉素合成相关的MaGA20ox2基因，所得突变体呈现出半矮秆的株型。

敲除RAP (reduced anthocyanin in petioles) 后，改变了草莓果实色泽，使得红色的草莓果实变成白色。

· 改变花色、花型、开花时间和花期

在猕猴桃中编辑AcCen4和AcCen基因后，植株早开花的效果极好。然而在蓝莓中却未能实现早开花的预期表型，因此，针对不同物种的特定性状，关键基因可能存在差异，这些关键基因的确定仍需大量的工作。

原文出自 Horticulturae 期刊

Rukavtsova, E.B.; Zakharchenko, N.S.; Lebedev, V.G.; Shestibratov, K.A. CRISPR-Cas Genome Editing for Horticultural Crops Improvement: Advantages and Prospects. Horticulturae 2023, 9, 38.

撰稿人：殷学仁

专栏简介

“晓果仁”专栏由Horticulturae 期刊编委殷学仁教授 (浙江大学) 主持。该专栏旨在对Horticulturae 期刊的典型论文进行点评与推荐，同时关注果树研究的最新进展。

专栏编辑

殷学仁 教授

浙江大学农业与生物技术学院

浙江大学农业与生物技术学院教授、博士生导师。曾先后承担国家自然科学基金 (优秀青年基金、面上项目、青年基金)、国家重点研发计划课题、公益性 (农业) 行业专项 (课题)、霍英东教育基金会青年教师基金、973计划 (子课题)、863计划 (子课题)、浙江省自然科学基金 (杰出青年基金)、教育部博士点基金等基金项目。

研究兴趣：果实发育与品质、果实采后生物学与技术、果树与环境响应、植物激素及其相互作用、分子生物学。

Horticulturae 期刊介绍

主编：Luigi De Bellis, University of Salento, Italy

期刊重点关注温带到热带园艺的所有领域以及相关学科，主题包括果树、蔬菜、花卉、苗圃和风景以及草药和香料作物等，研究涉及整个园艺供应链。

2021 Impact Factor：2.923

2021 CiteScore：1.8

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Time to Publication：35 Days