安徽医科大学王咸文教授团队携手中山大学陈森华研究员团队：从ADFTe4729中提取了分子活性化合物木霉素B(scheme1)。通过体外细胞学检测证实了其抗肿瘤作用，分子生物学证实了其抗肿瘤特性的分子机制。进一步发掘曲霉菌素 B 作为抗胶质瘤细胞候选物的潜力，为开发新的具有抗胶质瘤作用的分子化合物提供新的途径。

01内容简介

脑胶质瘤是最常见的恶性肿瘤，其复发率高，死亡率高。特别是胶质母细胞瘤(GBM)患者的预后非常差，手术、放疗和化疗患者的平均生存期仅约为15个月。胶质瘤化疗药物缺乏、耐药率高是导致治疗失败的重要因素。因此，开发新的、有效的胶质瘤化疗药物对延长生存期、提高生活质量和降低死亡率至关重要。近年来，海洋细菌提取物以其新颖的结构和显著的活性受到国内外抗癌药物研究者的广泛关注。由于海洋细菌的独特代谢途径，产物结构的自然资源为抗胶质瘤药物的开发提供了一种新的方法。其中，从热带盐生放线菌中分离出的一种次级代谢产物，具有很强的抗肿瘤作用。自发现以来，仅仅3年时间，它就进入了多发性骨髓瘤的第一阶段临床试验。具有强抗肿瘤活性和独特结构的化合物已引起学术界和工业界的广泛关注。起源于小单孢菌，硫代 Coraline 是一种具有显著抗肿瘤活性的降肽化合物，可诱导结肠癌细胞的细胞分裂停留在G1期并阻断肿瘤细胞，从而阻断肿瘤细胞从 S 期向 G2期和 M 期的转化。现已进入临床试验阶段。在以前的研究中，发现 ADFTe4729产生一种全新的吡咯类生物碱，其具有前所未闻的部分四氢 -5H- 呋喃[2,3-b]吡咯 -5-酮，曲古巴胺 A，其表现出优越的抗胶质瘤活性。因此，开发海洋天然产物的抗肿瘤活性具有很大的潜在药用价值。在本研究中，我们从ADFTe4729中提取了分子活性化合物木霉素B(scheme1)。体外细胞学检测证实了其抗肿瘤作用，分子生物学证实了其抗肿瘤特性的分子机制。发掘曲霉菌素 B 作为抗胶质瘤细胞候选物的潜力，将为开发新的具有抗胶质瘤作用的分子化合物提供新的途径。

Scheme 1. Trichobotrysin B inhibits glioma cell proliferation and induces apoptosis via the IL-6-mediated STAT3/JAK signaling pathway.

使用梯度程序通过 LC-MS 分析 ADFTe4729的粗提取物，然后进行 MS/MS 扫描，然后利用 GNPS 平台将 MS 数据转换为分子网络。结果表明，网络中的聚类节点主要由六个分子家族组成，其中三个以上的节点(Fig. 1A，B)。通过 GNPS MS/MS 文库匹配的结果，将曲霉素B 表征为簇 A 中的节点之一。通过 HR-ESIMS 光谱(m/z 416.2804[ M þ H ] þ)检测到曲霉素B，其化学式为 C25H37NO4。表明该分离物被证实为曲霉素B，一种具有十氢萘环的四氨酸衍生物(Fig. 1C)。这个分子最初是从南中国海沉积物中提取的海洋真菌毛霉(Trichobotrys effusa DFFscs021)中分离出来的次级代谢产物。在此，从 ADFTe4729中分离出曲霉菌素 B。此外，体外细胞试验验证了曲霉菌素 B 对胶质瘤细胞系 U251和 SNB19的细胞毒性。

Fig. 1. Trichobotrysin B isolation: (A) GNPS analysis of HR-MS/MS of culture extracts derived from Trichobotrys effusa 4729; (B) Application of MS/MS molecular network technology for identification and targeted isolation of trichobotrysin B from the Trichobotrys effusa 4729 extract using MS/MS molecular networking; (C) Structure of trichobotrysin B.

为了确定曲霉菌素 B 对胶质瘤细胞增殖和发育的影响，在与10μM 曲霉菌素 B 温育24小时的 U251和 SNB19肿瘤细胞中观察到形态学变化和增殖抑制(Fig 2A-D)。在曲霉菌素 B 处理组中，胶质瘤细胞密度降低，细胞形态变差，突触减少，呈现凋亡形态(Fig 2A 和 C)。从不同药物浓度和作用时间的 CCK-8结果可以看出，用5μM 曲霉菌素 B 处理的 U251细胞在24小时内显示出显着的值抑制作用(p < 0.001) ，而对于 SNB19细胞，10μM 曲霉菌素 B 在24小时处理后也显示出显着的抑制作用(Fig 2B 和 D)(p < 0.01)。在此基础上，以10μM曲霉素B 处理24h 为实验条件。

Fig. 2. Trichobotrysin B inhibits the proliferation of glioma cell lines. (A) U251 cell morphology treated with trichobotrysin B; (B) Viability of U251 cells; (C) SNB19 cell morphology treated with trichobotrysin B; (D) Viability of SNB19 cells. **p < 0.01; ***p < 0.0001.

采用集落形成法研究了不同浓度的曲霉菌素 B 对胶质瘤细胞增殖的影响。结果表明，在将0μM，5μM 和10μM曲霉素B 应用于 SNB19和 U251细胞后，克隆计数显着降低(Fig 3A-C)。结果表明，木霉菌溶酶 B 抑制胶质瘤细胞的集落形成。应用流式细胞术研究了曲霉菌素 B 对胶质瘤细胞周期的影响。将不同浓度(0μM，5μM 和10μM)的曲霉菌素 B 应用于胶质瘤细胞 SNB19和 U251,24小时后进行流式细胞术分析以确定细胞周期。根据研究结果，曲霉菌素 B 诱导胶质瘤细胞的 G0/G1期停滞，SNB19细胞系的 G0/G1期从33.75% 增加到51.72% ; U251细胞的 G0/G1期从41.85% 增加到52.2% (p < 0.01)( Fig 3D-F)。研究结果证实，曲霉菌素 B 抑制胶质瘤细胞集落发展，促进细胞周期停滞。

Fig. 3. Trichobotrysin B inhibits glioma cell colony formation and induces cell cycle arrest. (A) U251 and SNB19 colony formation ability treated with trichobotrysin B; (B-C) Clonal formation rate statistics; (D) U251 and SNB19 cell cycle flow diagram treated with trichobotrysin B; (E and F) Cell cycle arrest statistics. *p < 0.05, **p < 0.01; ***p < 0.0001.

研究结果表明，曲霉菌素 B 有效地抑制胶质瘤细胞的活力。我们检测了木霉素 B 处理的 GBM 细胞凋亡的百分比。流式细胞术检测细胞凋亡，结果表明，不同浓度(0μM，10μM，15μM)的曲霉菌素 B 均能显著提高胶质瘤 SNB19和 U251细胞24h 后的凋亡率。结果是浓度依赖性的(Fig A-C)。对 SNB19和 U251胶质瘤细胞进行24小时免疫印迹试验，检测不同浓度的凋亡相关蛋白。结果显示，细胞凋亡相关蛋白，切割的半胱天冬酶9(c-caspase 9) ，促凋亡蛋白 BAX 和切割的半胱天冬酶3(c-caspase 3)在曲霉菌素B处理后显着上调，抗凋亡蛋白 Bcl-2显着降低(Fig 4D-I)。以上结果表明，在胶质瘤细胞中，木霉素B可诱导细胞发生浓度依赖性凋亡。

Fig. 4. Trichobotrysin B induces apoptosis in glioma cells. (A) Flow cytometry for apoptosis of U251 and SNB19 cells after treatment with trichobotrysin B; (B) Early apoptosis statistics of glioma cells U251 after trichobotrysin B treatment; (C) Early apoptosis statistics of glioma cells SNB19 after trichobotrysin B treatment; (D–E) The expression levels of the apoptotic proteins BAX and Bcl2; (F-I) Expression levels of the apoptosis-related proteins Caspase 3, C-Caspase3, Caspase 9 and C-Caspase 9. *p < 0.05, **p < 0.01; ***p < 0.0001.

集中研究了曲霉菌素 B 通过抑制 JAKSTAT3信号通路在抑制胶质瘤细胞恶性特征中的作用。用0μM，5μM 和10μM 曲霉菌素 B 处理胶质瘤细胞24小时后，使用西方墨点法，测定磷酸化的 STAT3和磷酸化的 JAK2的活化水平，结果表明磷酸化的 STAT3和 JAK2的蛋白质表达水平在 U251和 SNB19细胞中以剂量相关的方式显着降低(Fig 5A)。蛋白质印迹分析显示，曲霉菌溶酶 B 以剂量依赖的方式抑制 IL-6诱导的 STAT3磷酸化(Fig 5B)。推测木霉素 B 抑制 IL-6介导的 JAK-STAT3信号通路的刺激，从而减少胶质瘤细胞的增殖和增加细胞凋亡。

Fig. 5. Effect of trichobotrysin B on the JAK-STAT3 signaling pathway. (A and C) Expression and semiquantitative statistics of Jak2, phosphorylated Jak2 and phosphorylated Stat3 in glioma cells after trichobotrysin B treatment; (B and D) Cells were pretreated with trichobotrysin B for 24 h and then stimulated with IL-6 (50 ng/mL) for 15 min *p < 0.05, **p < 0.01; ***p < 0.0001.

02论文通讯作者简介

王咸文

安徽医科大学东南学者，生物医学材料系

https://www.x-mol.com/groups/xianwenwang

高鹏

安徽医科大学，副主任医师

https://www.ayfy.com/info/1249/5956.htm

陈森华

中山大学海洋学院特聘副研究员，中山大学博士

https://www.scholarmate.com/P/sdRPMB

03资助信息

国家自然科学基金(52202343)

安徽省自然科学基金(2208085QC81,2208085MH251)

安徽医科大学科研基金(2021xkj131)

安徽医科大学与附属医院共建项目研究基金(2021lcxk017)

国家自然科学基金(2021xkjT028)

04原文信息

Xingliang D ,Junjuan F ,Dongdong L , et al. 

The marine natural product trichobotrysin B inhibits proliferation and promotes apoptosis of human glioma cells via the IL-6-mediated STAT3/JAK signaling pathway [J]. 

Smart Materials in Medicine, 2024, 5 (1): 66-74.

Smart Materials in Medicine 

Smart Materials in Medicine 是一份国际开放获取期刊，涵盖了智能材料在生物技术、医学等领域的应用。目前已被Scopus，DOAJ，EBSCO和CAS收录.

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