代谢学人

Nature Metabolism ：胆固醇代谢紊乱，RBFOX2来理清

撰文 | 申芸佳 朱丽君 刘爽 曹玉香 李国强

编辑 | 孟美瑶

校对 | 刘爽

背景介绍

哺乳动物中，具有多个外显子的基因多数会经历可变剪切（AS），产生多个亚型，进而导致转录本的复杂性。AS对于组织特异性蛋白质相互作用网络的建立和维持至关重要。由于同一基因不同亚型之间功能特异性不够明确，识别体内特定基因上游的剪切因子所涉及的技术难度极大，因此特定的AS是否调节特定的生理功能尚不清楚，它们在代谢疾病中是否发挥作用也不得而知。研究参与代谢调节的剪切因子及其亚型的特征有助于增加我们对疾病相关代谢进程的了解，促进RNA疗法的开发。目前，通过RNA治疗使肝脏中特定基因失活正在成为代谢疾病的潜在治疗策略，然而与剪切因子相关的RNA疗法还有待进一步探索。随着全球肥胖人数的增加，代谢相关的脂肪性肝病(MAFLD)已成为最常见的非传染性肝病。MAFLD包括肝脂肪变性(脂肪肝)到非酒精性脂肪性肝炎（其特征为炎症、肝细胞损伤和纤维化），并可能发展为肝功能衰竭、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。虽然从脂肪变性发展为非酒精性脂肪性肝炎的确切机制尚不完全清楚，但有证据表明，营养过剩和高热量饮食会导致脂质代谢失调，如磷脂、饱和脂肪酸、鞘磷脂、神经酰胺和胆固醇等的代谢紊乱。此外，有研究表明MAFLD与2型糖尿病和心血管疾病的发病相关，因此掌握MAFLD与心血管疾病风险增加和进展性肝损伤之间的联系将有助于确定新的治疗靶点。

近期在Nature Metabolism发表的一篇题为“Liver RBFOX2 regulates cholesterol homeostasis via Scarb1 alternative splicing in mice”研究中，研究人员发现前信使RNA(pre-mRNA) AS相关组分受肝脏代谢的选择性调节。RNA结合的fox-1同源物2 (RBFOX2)是肝脏中的关键剪切因子，参与调节脂质稳态相关基因簇的AS，包括清道夫受体I(Scarb1)，磷脂酶A2组VI (Pla2g6)，网格蛋白囊泡配体Numb和甾醇结合蛋白样9 (Osbpl9)。此外，研究人员还揭示了RBFOX2调节AS进程对致肥胖饮食的反应，证明RBFOX2调节的AS可以被FOXA1/2调控。通过剪切开关寡核苷酸(SSOs)调节Scarb1剪切可以逆转RBFOX2缺失引起的肝实质细胞脂毒性物质积累，减轻饮食诱导的肥胖相关的肝脏炎症，揭示了异构体特异性RNA治疗代谢性疾病的潜力。

敲黑板啦！

1.不同营养条件促进肝脏可变剪切发生变化；

2.抑制IRF7相关信号通路促进米色脂肪生物合成；

3.RBFOX2在肝脏中的表达受FOXA1/2控制；

4.Scarb1通过剪切开关寡核苷酸调控(SSOs)介导肝实质细胞中与RBFOX2相关的脂质变化。

研究结果

1.营养促进肝脏可变剪切机制发生变化 

为了研究健康和疾病两个不同状态下肝脏的代谢情况，研究人员对喂食对照饲料(CD)和高脂饲料(HFD)的小鼠在进食和禁食条件下的肝脏转录组(RNA-seq)和蛋白质组(TMT-MS)进行了分析(图1a)。通过蛋白质组鉴定出了所有的5999个蛋白质，主成分分析证实饮食对肝脏蛋白质组(图1b上)和转录组(图1b下)产生了不同的影响。GO分析表明，进食/禁食周期主要改变参与pre-mRNA剪切的“剪切体”蛋白的表达(错误发现率(FDR)为2.43×10⁻⁹)（小编注：FDR（false discovery rate），是统计学中常见的一个名词，翻译为错误发现率，其意义为是错误拒绝（拒绝真的（原）假设）的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值。其值越低表明结果可信度越高。）、“胰岛素信号”、“三羧酸循环”等核心代谢过程(图1c上，辅图1a,b)。同样，高脂喂养（HFD）也改变了肝脏中剪切体蛋白的表达(FDR = 4.72×10⁻²)(图1c下，辅图1c,d)。这表明参与调控肝脏pre-mRNA剪切机制的因子受营养信号的选择性调节，营养信号对pre-mRNA剪切和AS存在影响。通过对CD饮食和HFD饮食小鼠的肝脏RNA-seq AS谱分析，研究人员发现了一些与进食/禁食周期相关的显著变化(图1d)。HFD饮食促进的AS显著变化包括最明显的外显子跳跃(55%)，其次是保留内含子(13%)，选择性3'端可变剪切(A3SS)(14%)和选择性5'端可变剪切(A5SS)(11%)，以及互斥外显子(MXE)(7%)。鉴于糖摄入量的增加是饮食引起的肝脏疾病及其相关心脏代谢疾病的重要因素，因此研究人员接下来探索了高果糖(HFr)饮食（作为饮食诱导肥胖的替代模型）促进的AS。结果显示，HFr饮食诱导的AS变化最明显的同样是外显子跳跃(56%)，其次是内含子保留(17%)，A3SS (16%)，A5SS(9%)和MXE(2%)(图1d)。此外，与CD饮食小鼠肝脏相比，在饮食诱导的肥胖小鼠肝脏中，由进食/禁食周期引起的AS变化减弱(辅图1e)，表明肝脏AS网络的紊乱导致在肥胖中观察到的代谢可塑性减弱。总的来说，这些结果揭示了pre-mRNA AS程序在生理(进食或禁食周期)和病理(HFD和HFr诱导的肥胖)适应中的特定变化。

可变剪切

可变剪切（alternative splicing，AS）也叫选择性剪切，指从mRNA前体到成熟mRNA的过程当中，不同的剪切方式使得同一个基因产生多个不同的成熟mRNA，最终产生不同的蛋白质。可变剪切在真核生物体内广泛存在，对于人类基因组中包含多个外显子的基因而言，95%以上的基因都存在可变剪切。可变剪切导致了转录本的多样性，是一种重要的转录调控机制。 

    在不同组织、不同发育阶段或者不同的生理病理条件下，可变剪切会产生不同的剪切异构体（isofrom），这说明不同异构体具有特定的时间与空间作用，从而将可变剪切与正常的生命活动和疾病相关联。

可变剪切可以分为以下7种基本类型： 

    （a）ES（Exon skipping，外显子跳跃）指一个外显子从初始转录物上被剪切掉。如下图a所示，基因发生可变剪切形成两种不同的转录本，第1种转录本比第2种转录组本多一个外显子，我们将这种外显子称为inclusive exon，inclusive exon两侧的两个外显子称为constitutive exon。

    （b）A3SS（alternative 3′ splice site，可变的3’端）：基因发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的5'端剪切位点一致但3'端剪切位点不同。

      （c）A5SS（alternative 5′ splice site，可变的5’端）：基因发生可变剪切形成两种不同的转录本，它们的3'端剪切位点一致但5'端剪切位点不同。 

    （d）RI（Retained intron，内含子保留）：基因发生可变剪切形成两种不同的转录本，第2种转录本由retained Intron与两侧的外显子一起形成新的外显子。

    （e）ME（Mutually exclusive exons，互斥外显子）：基因发生可变剪切形成两种不同的转录本，两转录本之间相同的外显子称为constitutive exon， 不同的外显子称为inclusive exon，两个inclusive exon不能同时存在与同一转录本中， 只能分别存在于不同转录本中。这样的可变剪切事件称为Mutually Exclusive Exon。

    （f）AP（Alternate promoter，可变启动子）：基因的两个转录本的区别在于第一个外显子不同，这样的可变剪切事件称为Alternative First Exon。

   （g）AT（Alternate terminator，可变终止子）：基因的两个转录本的不同之处于最后一个外显子不同，这样的可变剪切事件称为Alternative last exon。

参考文献

[1] Benjamin J Blencowe,et al.Cell. 2006 Jul 14;126(1):37-47.

图1 营养促进肝脏剪切机制的变化

辅图1 剪切因子在肝脏特定代谢条件下的差异表达

2.剪切因子RBFOX2在肝脏中受饮食信号调节

为了研究在不同营养状态下控制肝脏AS的剪接因子，研究人员认为这些剪切因子应该具有以下特点：(1) 在肝脏或肝细胞中的表达可以被检测到；(2)在肝脏中发生AS的外显子内部或周围区域（即剪切因子与被剪切外显子结合的区域）有丰富的结合。因此，研究人员对肝脏生理(进食/禁食)和病理(饮食诱导的肥胖)状态下发生AS的外显子内部和周围的序列进行了基序富集分析，观察到剪切因子结合基序的显著富集，其中包括RBFOX2、CUGBP2、SRSF1、PTBP1和MBN1(辅图1f,g)。对人肝细胞中AS外显子内部和周围具有保守交联峰的剪切因子分析发现，在进食/禁食(图1e)、HFD诱导的肥胖(图1f)和HFr诱导的肥胖中(图1g)，排名前20%的剪切因子有8个分别为 U2AF2、RBFOX2、QKI、hnRNPC、PCBP2、TIA1、hnRNPM和TAF15。研究人员发现RBFOX2在肝脏中表达(图1H)，对小鼠单细胞RNA-seq数据分析发现RBFOX2在肝脏大部分是在实质细胞中表达 (图2A)。而其他可能参与AS调控的剪切因子则在多种肝细胞群中存在表达(辅图2)。接下来，研究人员构建了Alb-cre⁻Rbfox2^LoxP/LoxP(L^WT)和Alb-cre⁺Rbfox2^LoxP/LoxP(L^ΔRbfox2)（肝细胞特异性敲除Rbfox2）小鼠模型。免疫印迹分析结果显示，RBFOX2在L^ΔRbfox2小鼠的肝脏中未检测到，这证实了其在肝脏中绝大部分是在肝细胞中表达(图2b)。这些结果表明，RBFOX2可能在调节肝实质细胞AS中发挥作用。肝脏中Rbfox2的转录水平受到进食/禁食信号调控(辅图1a,b)。可变启动子和AS可以产生多种具有不同剪切活性的RBFOX2亚型，包括一个截短的RNA识别基序(RRM)。免疫印迹分析结果显示，HFD和HFr饮食诱导的肥胖都与肝脏中主要的RBFOX2亚型表达降低有关(图2c)，且这些变化与全长RBFOX2水平下降有关(图2d)，提示饮食诱导的肥胖情况下RBFOX2在肝脏中的功能可能被改变，并且RBFOX2可以协调AS变化以响应生理和病理代谢信号。

RBFOX2

RBFOX2基因编码一种RNA结合蛋白，该蛋白被认为是神经系统和其他细胞类型中可变剪切的关键调节因子。RBFOX2与许多可变剪切外显子下游的保守UGCAUG元件结合，并促进成熟转录本中包含可变外显子。此外，研究表明，RBFOX2还与雌激素受体1转录因子相互作用并调节雌激素受体1的转录活性，对神经、心肌和骨骼肌系统正常发育和功能维持具有十分重要的功能。

图2 RBFOX2是一种在肝脏中表达的剪切因子

辅图2 肝脏中RNA结合蛋白基因表达的单细胞RNAseq分析

3.RBFOX2通过AS调控胆固醇调节基因

       已有研究证明，剪切因子一般通过相互关联的顺式和反式作用元件调节AS。肝脏样本交联免疫沉淀(iCLIP)分析过程中，pre-mRNA的快速降解阻碍了肝脏内源性剪切因子直接靶点的鉴定，导致我们目前所获得的关于成人肝脏中维持或扰乱AS程序稳态的信息非常有限。为了克服这一问题，研究人员采用了增强型单核苷酸分辨率iCLIP (eiCLIP)实验方案（小编注：CLIP的英文全称为cross-linking immunoprecipitation，即交联免疫沉淀，是一种利用紫外交联技术，将RNA与蛋白之间互作的弱作用力（如范德华力、氢键）转化为强作用力（共价键），并连用免疫沉淀，探究RNA与蛋白互作位点的分子生物学技术。基于CLIP技术可以在整个转录组水平上检测RNA结合蛋白的结合位点或RNA修饰（m6A）位点。CLIP根据细胞处理方式和检测方式的不同，分为HITS-CLIP、PAR-CLIP、iCLIP。iCLIP（individual nucleotide–resolution cross-linking and immunoprecipitation）是一种单核苷酸分辨率的CLIP。该技术与普通CLIP的区别在于RNA结合序列5’端的接头是通过成环连接上去的。该方法相较于其他两种CLIP更为精确，可以精确到单个结合碱基），该实验方案可以增强RBFOX2交联pre-mRNA产物的回收(图3a和辅图3a)。pre-mRNA峰值分析证实富集产物确实与RBFOX2结合基序（U）GCAUG 结合(图3b)，富集产物中包括已知的RBFOX2直接靶点Ptbp2和Snrnp70(辅图3b,c)。先前研究表明RBFOX2蛋白以位置依赖的方式促进或抑制AS(辅图3d)。通过对L^WT和L^ΔRbfox2小鼠肝脏RBFOX2在AS外显子上游或下游的交联位置分析，研究人员发现与对照外显子(25.1%)相比，在肝脏中这种位置依赖性在增强可变剪切的外显子(50.0%)中比在抑制可变剪切的外显子(27.9%)中更强(辅图3e，图3c)。GO分析显示，RBFOX2高度富集于参与编码磷脂酰胆碱-固醇-O-酰基转移酶活性、脂蛋白颗粒受体结合蛋白、载脂蛋白受体结合蛋白和低密度脂蛋白(LDL)颗粒受体结合蛋白的转录本序列，提示RBFOX2参与调控脂质代谢(图3d)。其他靶点调控功能包括钙粘蛋白结合、无序结构域特异性结合和RNA结合蛋白。eiCLIP检测到的小鼠RBFOX2靶点人类同源基因富集在脂代谢表型，如低密度脂蛋白胆固醇或甘油三酯(TGs)的代谢相关基因转录本序列上(图3e)。这些基因包括Scarb1，编码B类清道夫受体I（介导胆固醇摄取，血浆HDL修饰和胆汁胆固醇的高密度脂蛋白(HDL)受体）；Pla2g6（编码磷脂酶A2组VI）；Sec31a（COPII囊泡运输系统的核心成分，涉及固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)激活和ApoB脂蛋白的加工）；Osbpl9（固醇结合蛋白基因）和Numb（编码一种连接蛋白，参与了网格蛋白依赖的胆固醇从胆汁逆向转运至肝脏）。对Scarb1 pre-mRNA转录本的eiCLIP分析显示，RBFOX2与外显子12的上游结合。对L^ΔRbfox2小鼠肝脏的PCR分析证实，RBFOX2促进Scarb1外显子12跳跃(图3f)。另外，RBFOX2还促进Pla2g6(图3g)、Numb(图3h)、Osbpl9(图3i)和Sec31a(辅图3f)中特定外显子的跳跃。对人肝癌细胞中RBFOX2结合的pre-mRNA转录本分析证实了RBFOX2在人类转录本外显子可变剪切的保守性(辅图3g-j)。以上结果说明，RBFOX2直接参与调节与肝脏脂质稳态相关基因的AS。

图3 RBFOX2在肝脏中通过一组脂质调节基因控制AS

辅图3 RBFOX2介导的AS在肝脏中的调控分析

4.RBFOX2在生脂饮食中调节胆固醇代谢

接下来研究人员分别对L^ΔRbfox2小鼠进行对照饮食、HFD饮食或HFr饮食喂养，结果发现正常饮食下L^ΔRbfox2小鼠的体重(辅图4a-c)和葡萄糖耐量(辅图4d-f)均未出现显著变化，这表明RBFOX2缺失不会干扰正常的肝脏发育。而HFr饮食条件下L^ΔRbfox2雄性小鼠的总胆固醇水平显著降低(图4a)，但TG水平没有显著降低(图4b)，L^WT和L^ΔRbfox2雌性小鼠也有相似表型(辅图4g,h)。肝脏是维持脂质稳态的核心。为了研究与血脂变化相关的代谢特征，研究人员对L^WT和L^ΔRbfox2小鼠的肝脏进行了脂质组学分析。主成分分析显示，与CD饮食的小鼠相比，HFr饮食导致了总体代谢组学特征的显著变化(图4c)。在HFr饮食小鼠中，RBFOX2敲除与肝脏脂质含量的增加有关，尤其是胆固醇酯、胆固醇和鞘磷脂(图4d)。虽然未观察到肝脏脂肪变性有差异(辅图4i)，但L^ΔRbfox2小鼠的TG组成发生变化，有更长的多不饱和脂肪酸酰基(PUFA)链(由PUFA/非PUFA TG比值表示)(图4d)。当喂食HFD时，L^ΔRbfox2小鼠也表现出肝内总胆固醇酯的增加。然而，与L^WT小鼠相比，CD饮食的L^ΔRbfox2小鼠未观察到胆固醇或鞘磷脂的整体变化(辅图4j-m)，也未观察到血液胆固醇含量的变化(辅图4n)。以上结果表明，当L^ΔRbfox2小鼠进行HFr饮食饲喂时，部分表型加剧。CLIP测序分析表明RBFOX2的靶点在人类中是保守的(辅图3g-j)。为了进一步确定RBFOX2是否参与人肝细胞的脂质代谢，研究人员在诱导多能干细胞(iPSC)衍生的肝实质细胞中使用RNA干扰(RNAi)沉默RBFOX2(图4e)。结果显示，RBFOX2敲减不影响成熟肝实质细胞分化标志物如ASGPR2、SERPINA1和SERPINA2的表达(辅图5a)。与人肝脏中RBFOX2与pre-mRNA结合一致，人肝实质细胞中RBFOX2缺失的影响在SCARB1、SEC31A、OSBPL9、PLA2G6和NUMB AS中的作用保持一致(图4g-k)，表明了这一调控网络的保守性。此外，人肝实质细胞的脂质组学分析表明，RBFOX2缺失导致脂质组成的变化(辅图5b)，包括胆固醇酯和鞘磷脂的积累(图4l,m)。这些结果表明RBFOX2在参与调节脂质代谢AS中的保守性。L^ΔRbfox2小鼠肝脏中胆固醇积累、血浆中胆固醇降低，表明RBFOX2在肝脏胆固醇摄取、运输和外排的调节中起着特定的作用。为了进一步了解这些机制，研究人员比较了HFr饮食的L^WT和L^ΔRbfox2小鼠RNA-seq数据。结果发现，肝脏中RBFOX2的缺失引起胆固醇生物合成、甲羟戊酸途径（小编注：甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway）是以乙酰辅酶A为原料合成异戊二烯焦磷酸和二甲烯丙基焦磷酸的一条代谢途径，存在于所有高等真核生物和很多病毒中。该途径的产物可以看作是活化的异戊二烯单位，是类固醇、类萜等生物分子的合成前体），肝脏X受体(LXR)途径（小编注：肝脏X受体（LXR）是核受体超家族中的一员，参与调控全身的脂质代谢及炎症反应）和法尼醇X受体途径（小编注：法尼醇X受体（FXR）是一种胆汁酸（BA）受体，被特定BA代谢物激活后发挥转录因子作用，参与调控BA的合成和肠肝循环，影响机体的糖脂代谢，在结直肠癌和肝癌等癌症中也有潜在作用）的转录变化，这与RBFOX2在脂质和胆固醇代谢中的作用一致，并且氧化磷酸化和线粒体功能也发生了变化。先前的研究表明，胆固醇代谢由位于内质网的转录因子家族SREBPs参与的反馈机制调控。一项针对胆固醇稳态相关基因的分析显示，L^ΔRbfox2小鼠肝内胆固醇增加与生物合成关键基因(包括Srebf2、Hmgcs1和Hmgcr)表达无关(辅图5c)，这表明在L^ΔRbfox2小小鼠中这种反馈调节保持不变。Abca1、Abcg8和Nr1h2 (LXR beta)和Nr1h3 (LXR alpha)表达增加，表明在RBFOX2缺失的情况下，胆固醇积累引起胆固醇外排途径的代偿性增加(辅图5c)。肝脏中HDL-胆固醇反向吸收和向胆汁酸转化是胆固醇通过胆汁排泄的主要途径。因此研究人员验证了L^ΔRbfox2小小鼠血液中胆固醇的降低和肝内胆固醇的增加是否会导致胆汁酸水平的增加。结果显示，L^ΔRbfox2小小鼠胆汁中胆汁酸增加，其中包括牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺熊去氧胆酸和胆酸(辅图5e-k)。与L^WT对照小鼠相比，HFD饮食时，L^ΔRbfox2小小鼠肝内特定胆汁酸也有所增加(辅图5l-u)。为了探究RBFOX2活性是否可以调节下游AS网络以响应饮食变化，研究人员分别对L^WT和L^ΔRbfox2小小鼠进行对照饮食或致肥胖饮食喂养，并分析了这些小鼠Scarb1、Pla2g6和Numb的AS变化。结果显示，在LWT小鼠中，HFr饮食促进了AS的显著变化，而L^ΔRbfox2小小鼠在Pla2g6(辅图6a)、Scarb1(辅图6b)和Numb(辅图6c)上未能诱导AS变化。为了进一步分析RBFOX2如何调控AS网络，研究人员探究AS变化是否与活性RBFOX2水平下降或非活性(缺乏RRM基序)水平升高有关(图2c,d)（小编注：RNA结合蛋白含一个或数个RRM结构域及附属结构域，参与RNA前体的剪切、RNA的细胞定位、RNA的稳定性等多种转录后调控过程。在RRM基序中含有许多保守的氨基酸以保证对RNA的结合活性）。研究人员构建了缺乏RRM基序的RBFOX2 (RBFOX2-Δ6)腺相关病毒(AAV)载体(图5a,b)。实验结果表明，在小鼠和人肝实质细胞中过表达RBFOX2-Δ6并不能模拟RBFOX2失活相关的AS变化(图5c)（小编注：即缺乏RRM基序的RBFOX2并没有dominant negative的作用）。相反，过表达全长的活性RBFOX2 (图5d，辅图6G)促进了与RBFOX2缺失相反的AS变化(图5e，辅图6G)，这表明，与非活性形式的RBFOX2相比，活性RBFOX2的水平与肝脏中AS调控关系更为密切。此外，LC-MS/MS脂质组学显示，活性RBFOX2过表达与肝脏(图5f)和胆汁(图5g)中胆固醇的降低有关。RBFOX2的过表达也与血液中HDL-胆固醇的轻微升高有关，但未达到统计学意义(图5h)。这些结果证实，RBFOX2调节了脂质代谢相关基因的网络，而全长活性RBFOX2的表达变化可以改变生脂饮食下的胆固醇代谢。

胆固醇代谢

作为哺乳动物体内含量最丰富的甾醇类分子和细胞膜的基本组分之一，胆固醇能与邻近脂类分子作用调节膜的刚性、流动性和渗透性，或与跨膜蛋白结合维持或改变后者的构象。胆固醇也是氧化甾醇和甾醇类激素的必备合成前体。胆固醇代谢平衡对维持细胞和机体的生命活动至关重要，其代谢异常与心脑血管疾病、神经退行性疾病及肿瘤等的发生密切相关。胆固醇代谢包括内源合成、外源摄取、外排和酯化等四个主要部分。胆固醇合成主要发生在肝脏，通过近30步酶促反应将乙酰辅酶A转化为胆固醇分子。新产生的胆固醇与甘油三酯组装成极低密度脂蛋白（VLDLs）分泌到血液中或以脂滴的形式在细胞内储存。饮食中的胆固醇可被小肠细胞表面的NPC1L1介导内吞，继而和酯化的胆固醇组装成乳糜微粒分泌。VLDL在血液中转变为低密度脂蛋白（LDLs），被外周组织细胞表面的LDL受体（LDLR）结合并内吞。LDL然后被分选进溶酶体，水解释放出游离的胆固醇。这些胆固醇通过溶酶体-过氧化物酶体膜接触等机制被继续运输到其它细胞器或质膜发挥其生物学功能。在大部分组织的细胞中，多余的胆固醇能通过ATP结合盒（ABC）转运蛋白家族蛋白ABCA1与ABCG1外排至血液，与载脂蛋白ApoA-I形成高密度脂蛋白（HDLs）。在肝、肠细胞中，胆固醇可通过ABCG5与ABCG8外排到胆汁或肠腔，被循环利用或排出体外。除了胆固醇外排之外，过量的胆固醇还可通过与胆固醇酯化酶ACAT1直接结合，进而被ACAT1转变为胆固醇酯储存在脂滴中。这些复杂的过程在多重水平上受严密严格调控，细胞有多种机制能感知并响应代谢状态以维持胆固醇代谢平衡稳态。

参考文献

[1]Pei-Shan Li,et al.Nat Med. 2014 Jan;20(1):80-6.

[2] Ying-Yu Zhang,et al.Science. 2018 Jun 8;360(6393):1087-1092.

图4 RBFOX2控制肝脏的脂质稳态

图5 病毒介导的肝脏中RBFOX2-Δ6和RBFOX2 WT的过表达

辅图4 RBFOX2参与胆固醇稳态的调节

辅图5 RBFOX2调节人肝实质细胞脂质代谢

辅图6 在喂食CD、HFD或HFr饮食的小鼠中，直接RBFOX2靶点的AS定量

5.RBFOX2在肝脏中的表达受FOXA1/2控制

鉴于RBFOX2具有多个启动子的复杂结构，为了找到人类肝脏中RBFOX2的上游调控因子，研究人员使用了转录起始位点的FANTOM5 CAGE数据集进行分析(图6a)。RBFOX2在人海马体或主动脉平滑肌中的表达由一个近端和一个远端启动子驱动，两者活性水平相似。而在肝实质细胞中，远端启动子主要调控RBFOX2的表达(与近端启动子相比变化了三倍)。科研人员在CAGE数据集中还发现人肝实质细胞RBFOX2存在第三个启动子，与先前报道的RBFOX2启动子不重叠(图6a)。人肝实质细胞中大部分的RBFOX2转录在该启动子和远端启动子的共同作用下完成。ChIP-seq数据集显示在成人肝脏中两者均在H3K4me3和H3K27ac富集。对肝脏ChIP-seq数据集分析表明，在人类(图6a下)和小鼠(辅图6h)中RBFOX2启动子与FOXA1/2结合。FOXA1/2是翼状螺旋转录因子，与胆汁酸代谢和保护肝脏胆汁淤积有关。为了验证FOXA1/2在RBFOX2调控中的作用，研究人员在小鼠肝癌Hepa1-6细胞中敲减FOXA1和FOXA2，结果发现RBFOX2表达显著降低(图6b)。相反，在HepG2细胞中过表达FOXA1可显著增加RBFOX2表达，但与RBFOX1/3表达无关(图6c)。以上结果表明，RBFOX2在肝脏中的表达受FOXA1/2的调控。

图6 Rbfox2在肝脏中的转录调控

6.Scarb1是RBFOX2的潜在治疗靶点

为了阐述RBFOX2在脂质稳态中发挥作用的分子机制，研究人员设计了剪切开关寡核苷酸（SSOs）来调节RBFOX2下游靶点的AS，并采用PCR和毛细管电泳（小编注：毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。作为分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学从微升水平得以进入纳升水平，并使单细胞分析成为可能）检测SSOs的效果。SSOs对每个剪切事件都具有显著的“开关”作用，并用于随后进行的原代肝细胞脂质组学分析。LC-MS代谢组学显示，缺乏RBFOX2的肝细胞中脂质积累增加(辅图6i)，表明RBFOX2参与调控肝细胞脂质代谢。虽然SSO7.9促进了Numb外显子3的改变，但不会引起显著的脂质代谢变化 (辅图6j)；而针对Numb外显子9、Sec31外显子23、Pla2g6外显子10、Osbpl9外显子6和Scarb1外显子12的SSOs则引起了特定的脂质组成变化(辅图6j)，表明这些基因的不同亚型介导了RBFOX2的作用。

SSOs诱导Numb外显子9的跳跃(辅图7a)逆转了许多脂类的积累，包括磷脂PC(36:3)、PC(40:7)、PE(38:5)、PC(38:4)、PC(36:2)、PC (40:5)；TGs，例如TG(58:8)、TG(62:13)、TG(56:7)、TG(56:2)、TG(54:2)和其他(辅图7b)。较短的Sec31a亚型(外显子23跳跃)的表达与PC(36:2)、PC(42:4)、PC(38:1)、TG(52:1)、DG(34:3)或lysoPC(18:2)和lysoPC(22:6)等脂类水平升高相关(辅图7c,d)。在野生型肝细胞中过表达较短的Osbpl9亚型(外显子6跳跃)显示出类似于RBFOX2缺失的肝实质细胞中Cer(40:2)、TG(50:1)、TG(51:1)、PC(32:0)、PC(34:0)和DG(38:4)等脂类的增加 (辅图8a,b)。另外，包含外显子10的Pla2g6亚型表达与脂质组成的微小变化相关(辅图8c,d)。有文献报道包含外显子12的Scarb1是典型的SR-BI亚型，而跳过该外显子会生成具有不同羧基末端结构域的可变受体，称为SR-BII。SR-BI/II是一种具有包括极低密度脂蛋白(VLDL)和高密度脂蛋白(HDL)在内多种配体的清道夫受体，参与胆固醇、胆固醇酯、磷脂PC、鞘磷脂、溶血素c等脂类的转运。然而，这些不同的剪切体对肝脏脂质的整体影响和病理生理意义尚未被报道。SSO8.3对原代肝实质细胞中包含外显子12的Scarba1具有明显的抑制(辅图9a)。LC-MS分析显示，SSO8.3治疗逆转了肝实质细胞中与RBFOX2缺失相关的脂质代谢变化(辅图9b)，如总神经酰胺增加(辅图9c)，PUFA/非PUFA TG比值(辅图9d)以及大量SMs和TGs(辅图9g-i)。有研究证明肝内胆固醇、神经酰胺、鞘磷脂和其他脂毒性物质水平的升高与脂肪性肝炎的发病有关。SSO8.3在减少肝实质细胞中这些脂类含量的作用提示，促进SR-BII亚型表达可能有助于缓解体内肥胖诱导的炎症。为了验证这一点，研究人员将SSO8.3、对照SSO(Scr)或生理盐水注射到HFr饮食的小鼠中(图7a，上)。结果发现，SSO8.3在肝脏中表现出强大的抗包含外显子12的Scarb1的活性(图7b和辅图9j)。SSO8.3治疗不会引起明显的毒副作用，如体重减轻(图7a，下)或转氨酶增加(辅图9n-o)。注射SSO8.3的小鼠肝脏巨噬细胞浸润减少(图7c)，炎症(Arg1、F4/80和Tnfa)和纤维化(Tgfb1和Col1a1)标记物的表达显著下调(图7d)。并且与肝实质细胞脂质积累降低一致的是(图7e,f)，SSO8.3治疗的小鼠肝脏/体重比降低(辅图9p)，胆汁中胆固醇和磷脂减少(图7g)，表明胆固醇反向运输到肝脏减少。转基因小鼠研究表明，Scarb1的全身敲除或肝脏特异性敲除与血浆VLDL、LDL和HDL水平升高和动脉粥样硬化增加有关（小编注：VLDL、 LDL携带有大量的甘油三酯、胆固醇和胆固醇酯，在动脉中流动时，VLDL、 LDL可以在动脉内膜表面脂蛋白脂酶的作用下，分解并入侵动脉壁，促进动脉粥样硬化的发生发展；而HDL则能通过接收血液和肝外各组织细胞内多余的胆固醇，将肝外组织细胞内的胆固醇通过血液循环转运回到肝脏，在肝脏中进行代谢转化，抑制动脉粥样硬化的发生发展。因此提升体内HDL水平，降低VLDL和LDL可以缓解动脉粥样硬化。），而过表达SR-BI则具有相反的效果。SSO8.3治疗导致小鼠血浆总胆固醇水平轻微升高，TGs下降(图7h)。这些结果表明，通过增加SR-BII亚型的表达，SSO8.3治疗可对VLDL和HDL水平产生特定影响。即VLDL显著降低，HDL和LDL水平升高(图7i)。为了进一步证实这些结论，研究人员对脂蛋白中分离的脂类含量进行了定量，揭示了脂蛋白组成的主要变化，结果发现在SSO8.3治疗后VLDL胆固醇含量下降，而HDL和LDL胆固醇含量增加(辅图10a-c)。此外，SSO8.3治疗与脂肪生成基因(辅图10d)或肝脏中总TG含量的变化(辅图10e)无关。基于上述原因，虽然无法排除VLDL分泌减少的影响，但总VLDL和LDL、TG血液水平的降低表明SSO8.3治疗促进了VLDL脂肪分解和残留物的形成。因此，RBFOX2协调肝脏中的AS网络，促进脂质代谢的特定变化，共同调节包括胆固醇、鞘磷脂和磷脂在内的脂质稳态。此外，SR-BI/II剪切开关可以实现靶向治疗以缓解肝脏炎症和改变脂质分布。

剪切开关寡核苷酸

剪切开关寡核苷酸(splice-switching antisense oligonucleotides，SSOs)是一种可与核内前体mRNA的靶序列进行碱基配对的短合成反义序列。其通过阻断RNA-RNA碱基配对或蛋白质-RNA的相互作用来改变转录本的正常剪切。pre-mRNA的剪切是绝大多数蛋白质编码基因正确表达所必需的，通过改变pre-mRNA的剪切过程提供了一种从基因层面控制蛋白质产生的手段。因此，由SSOs靶向这一过程为正常剪切中断导致突变引发的疾病提供了一种潜在的治疗方式。

参考文献

[1]Havens MA,et al.Nucleic Acids Res. 2016;44(14):6549-6563.

图7 Scarb1介导肝实质细胞中与RBFOX2缺乏相关的脂质变化，并可通过剪切开关寡核苷酸调控

辅图7 RBFOX2下游靶点在肝实质细胞脂质代谢中的作用

辅图8 Osbpl9和Pla2g6异构体在脂质代谢中的作用

辅图9 Scarb1剪切变体在脂质代谢中的作用

辅图10 体内用SSO8.3处理促进脂蛋白重塑

7.体内用SSO8.3处理促进脂蛋白重塑

以上数据表明RBFOX2缺乏与胆固醇生物合成或脂肪生成的变化无关(辅图5c和10d)。此外，在RBFOX2缺失情况下增加SR-BI介导的脂质摄取有助于增加胆固醇和其他脂质的积累。为了验证增加反向胆固醇摄取和排泄到胆汁的机制是否为RBFOX2缺失引起的血浆胆固醇变化的基础，研究人员在同时表达密码子得到优化的SR-BI或SR-BII的AML12肝实质细胞中使用siRNA抑制内源性Scarb1的表达(图7j和辅图10f)。结果显示，SR-BI和SR-BII的表达水平相当(辅图10g)，并且SR-BI亚型的表达与1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基氨基氰高氯酸盐(Dil)-HDL脂蛋白脂质摄取的增加有关(图7j)。为了进一步探究SR-BI/II亚型在体内如何介导RBFOX2发挥作用，研究人员用Scr或SSO8.3治疗L^WT和L^ΔRbfox2小鼠。实验结果表明，SSO8.3治疗有效地恢复了L^ΔRbfox2小鼠肝脏中SR-BI与SR-BII的比值(辅图10h)。分离血浆脂蛋白并定量脂质组成，结果显示L^ΔRbfox2小鼠HDL中的胆固醇和磷脂含量降低，而通过恢复SR-BI与SR-BII的比例，这些差异被消除，证实了这种亚型转换对肝脏中RBFOX2作用的贡献(图7k)。肝脏中RBFOX2失活导致胆汁中胆固醇升高(图7l)，而RBFOX2过表达则导致相反的效果(图5g)。通过SSO8.3治疗转换Scarb1亚型表达，逆转了胆汁中的胆固醇排泄(图7l)和血浆总胆固醇水平(辅图10j)，进一步证实了SR-BI/II介导的反向胆固醇转运是RBFOX2在胆固醇代谢中作用的基础。血浆LDL和VLDL的纯化和分析显示，RBFOX2缺乏与胆固醇的变化相关，但未达到统计学意义，这表明RBFOX2在胆固醇HDL摄取中起着重要作用(辅图10k,l)。总的来说，以上这些结果揭示了RBFOX2在生脂饮食下控制脂质代谢的作用，并表明SR-BI/SR-BII通过亚型转换调节HDL稳态。

胆固醇逆向运输

“胆固醇逆向运输”是指将肝外组织细胞内的胆固醇通过血液循环转运回到肝脏，在肝脏中进行代谢转化再排出体外的过程。胆固醇逆向运输包括小肠吸收的乳糜微粒进入肝脏和肝外组织内多余的胆固醇进入肝脏代谢这两部分。小肠吸收的乳糜微粒进入血液后，与HDL（高密度脂蛋白）表面的Apo（载脂蛋白）E和ApoC-II相互结合。ApoC-Ⅱ是LPL（脂蛋白脂酶）的激活剂，可以通过激活LPL催化乳糜微粒和VLDL（极低密度脂蛋白）中的TG（甘油三酯）分解为脂肪酸。释放的脂肪酸大部分扩散到相邻的肌细胞中进行能量代谢或进入脂肪细胞中进行能量储存。水解后的乳糜微粒表面的磷脂和Apo往HDL移动，颗粒变小，转变为乳糜微粒残粒（此时主要富含胆固醇），被肝脏LDLR（低密度脂蛋白受体，主要通过识别ApoE或ApoB100介导胆固醇的转运）或SR-BI （B族Ⅰ型清道夫受体清道夫受体，主要通过识别ApoA或Apo(a)介导胆固醇的转运）识别并摄取。其他肝外组织细胞内多余的胆固醇则可以通过ABCA1（ ATP结合盒转运体A1）转移到乏酯的ApoA-I上，形成新生HDL（新生HDL也可由肝或小肠合成）；新生HDL在LCAT（卵磷脂胆固醇脂酰转移酶）作用下形成成熟HDL，并接收通过ABCG1介导流出的胆固醇，将肝外组织细胞内的胆固醇通过血液循环转运回到肝脏。HDL通过LDLR或SR-BI进入肝细胞并进行代谢转化。

参考文献

[1]Luo J, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020 Apr;21(4):225-245.