编译：微科盟阿Z，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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在这项普遍的园艺研究中，我们鉴定了15072个不同的16S rRNA操作分类单位（OTUs，97%的相似性），并从ITS2区域鉴定出1027个真菌OTUs。

图1. 在本研究中使用的种质时间序列对氮肥使用随时间的变化进行了映射。玉米特定氮素利用率是根据原文参考文献[15]得出的。图片突出了随时间变化的根系表型，这来自原文参考文献[18]。

1 玉米种质时间序列中的根系微生物群响应

种质发展的十年、杂种遗传群体和基因型对根际微生物群落组成均有显著影响。植物基因型解释了根际微生物群的大量变异（PERMANOVA原核生物：R² = 0.17，p < 0.001；真菌：R² = 0.13，p < 0.001）。当我们对基因型平均微生物组进行分析时，我们发现种质发展的十年解释了原核微生物组16.79%的变异。相比之下，杂优群解释了8.1%的变异（图2A，B，十年p < 0.01，杂优群p < 0.008，表S4.1）。真菌微生物群对种质的时间序列没有明显的反应（p = 0.37），但在杂优群之间存在差异（p = 0.028）（图2C，D和表S4.2）。

图2. 玉米种质时间序列中细菌和真菌群落的变化。从根际微生物组样本中获得的原核16SrRNA基因序列（A，B）和真菌ITS基因序列（C，D）之间的Bray-Curtis差异进行NMDS排序，比较代表不同种质发育年限（A，C）或杂优群（B，D）的玉米基因型之间的原核和真菌群落组成。本研究包括的两个杂优群是非硬秆（NSS）和硬秆（SS）。

2 氮循环官能团对种质时序的响应

通过对氮循环功能基因的分析，我们发现了1498个nifH OTUs、95个古细菌amoA OTUs、200个细菌amoA OTUs、8632个nirK OTUs、1186个nirS OTUs、1068个norB OTUs和1864个nosZ OTUs。作为对种质时间序列的响应，7个氮循环基因中有3个显示了群落成员的变化，7个氮循环基因中有3个在每ng DNA的拷贝数上发生了变化（表S5）。

3 固氮基因

在种质时间序列上固氮类群的募集有明显变化（图3A和表S5）。通过固氮酶nifH基因检测到的固氮菌的组成受到种质发展的十年（R² = 0.16，p < 0.001）和杂优群（R² = 0.13，p < 0.009，图3A，表S6.1）的显著影响。qPCR结果还表明，在整个种质时间序列中，微生物组中nifH的丰度显著降低（r = -0.44，p < 0.05，图3B，表S7.1中线性模型统计）。即使在我们的实验中使用氮肥消除了对氮素固定的任何依赖，但仍发现了这些差异。

图3. 玉米种质时间序列中氮循环基因的变化。A玉米根际nifH组合在数十年种质发展过程中的NMDS排序比较。B玉米种质时间序列中nifH基因拷贝数的线性回归。C NMDS排序比较了几十年种质发展过程中细菌氨氧化剂组合的组成。D玉米种质时间序列中古细菌amoA和细菌amoA基因丰度总和的线性回归。E NMDS排序比较不同育种年代的反硝化菌组合（基于nirS基因）。F反硝化基因（nirS、nirK、norB、nosZ）平均qPCR丰度的线性回归。氮循环基因统计分析的完整清单在补充材料中给出：表S5-7和图S4。

4 硝化基因

种质时间序列和杂优群对硝化菌的募集（由细菌和古细菌氨单加氧酶-amoA的基因序列表示）优有显著的影响。我们发现细菌amoA基因的组成发生了显著变化（R² = 0.13，p < 0.05，图3C，表S6.2），但没有看到细菌amoA的丰度随时间序列的变化（p = 0.14，表S7.2）。古硝化菌的群落组成在时间序列上没有变化，但古细菌amoA基因的丰度确实增加了（p < 0.05，图S4，表S6.3、S7.3）。细菌和古细菌amoA的总基因丰度与我们的时间序列显著相关（r = 0.47，p < 0.05，图3D，表S7.4）。

5 反硝化基因

几个反硝化基因在时序和杂优群之间存在显著差异（图3E、F和S5，表S5、S6.4-7）。总体而言，反硝化细菌群落的变化与时间序列的关系最弱，但始终由杂种遗传群驱动（表S6.4-7）。具有细胞色素cd1型亚硝酸还原酶（nirS编码）的反硝化菌，是唯一一个随着种质发展而改变其组成的反硝化菌（p = 0.07，图3e，表S6.4）。只有一氧化氮合酶（norB）基因丰度与时间相关（p = 0.056，表S5、S6.7）。所有其他反硝化基因与时间序列缺乏显著的相关性（表S7.5-9）。为了总结基因丰度结果，我们对所有反硝化基因进行了平均，并将平均丰度与时间序列进行了回归（图3F）。虽然这种回归不显著（p = 0.35，表S7.9），但基因丰度与时序仍呈正相关（r = 0.22）。

6 响应种质时序的类群的鉴定及其潜在功能

WGCNA确定了三组独特的OTUs（模块），它们对种质时间序列有显著的响应（图4A和表S8）。模块1和模块2的OTUs与种质资源释放的十年呈正相关，模块3的OTUs与时间呈负相关。模块1含有98个OTUs，以变形杆菌为主。模块2含有140个OTUs，以放线菌为主。模块3含有178个OTUs，以变形杆菌为主。表S9列出了每个模块的主要分类类别。使用PICRUSt2进行元基因组功能预测，来预测WGCNA鉴定的分类群的功能。图S6-7给出了每个模块中分类单元的元基因组功能预测。PICRUSt2预测模块1中的分类群有304条路径，模块2有286条路径，模块3有378条路径。在所有模块中，存在高度共享的预测代谢途径（图4B）。模块1和2（类群在时间序列上增加）总共只包含5条在模块3中没有的独特路径。模块3（类群在时间序列上的相对丰度降低）有62条独特的路径（图4B和表S10）。所有模块都显示了跨种质时间序列的路径预测丰度的变化：模块1中83%的通路、模块2中85%的通路和模块3中78%的通路在种质时间序列中显著改变（表S11）。与20世纪60年代、70年代和80年代发布的品系相比，20世纪40-50年代开发的种质根际微生物群落在预测的途径丰度上最明显。当比较1960-70年代至80年代玉米品系间预测的微生物代谢途径差异时，发现丰度差异很小或没有差异（0-0.002%）。这一分析使我们能够确定对我们的时序反应最强烈的路径（表S12）。模块3显示了我们的三个十年分类中最复杂的富集和耗竭模式（图S6A）。模块1和模块2虽然在分类上是不同的，但在功能上似乎是冗余的。模块3显示出与有机氮源降解有关的途径在时间序列上的减少（图S6B和表S12）。随着时间的推移，预测三个模块都包含更多与有氧呼吸和氨基酸合成有关的基因途径（图S6C、D和表S12）。对相关分类单元进行PICRUSt2分析。补充资料中提供了描述和分析。

图4. 基于WGCNA和PICRUSt2代谢途径预测，玉米根际微生物群的分类单元和预测的代谢途径。A一个与种质时间序列显著相关的模块（层次聚类的OTUs）。模块成员在大小和分类组成上各不相同，这里按门分组。表S9中列出了主要的类别。B维恩图显示了三个模块共有的代谢途径。有关路径的信息如表S10-12所示。

7 跨时间序列的基因组变化

对这些玉米品系的基因组变异进行了补充分析，以评估我们是否能从机制上研究导致我们观察到的微生物组模式的表型。首先，我们利用TASSEL扫描了时序群体的单倍型多样性，发现了87个大的遗传区域（p < 0.05），根据Tajima’s D统计，显示出最近经历选择事件的证据。其中85个区域建议进行选择性扫描，2个区域建议进行平衡选择（补充材料S8）。接下来，我们试图确定基因组变异的变化是否与我们的时间序列时间线的变化相对应（图S9）。利用玉米HapMap，我们首先确定了TASSEL中的群体G矩阵，然后找到了解释大部分遗传变异的NMDS轴（图S2和S9）。然后，将这些主要的NMDS轴相对于我们的时间序列时间轴进行回归。综上所述，对本研究中使用的玉米品系的额外遗传分析表明，在玉米发育的这一时期，多重等位基因和相当数量的遗传变异发生了变化。不幸的是，这项研究的设计缺乏确定驱动这种时序微生物群模式的确切基因和特征的能力。

1 植物根际微生物群在一定程度上受到植物遗传学的影响。在这里，我们提供了几个例子，表明在不断变化的农艺环境（即合成氮增加、种植密度增加）中，对植物基因型的选择（通过育种）推动了植物微生物群募集的变化。我们发现，根际微生物群募集的改变反映在硝化和固氮的功能基因中以及预测的代谢途径。最终，这些结果表明，育种改变了玉米根际土壤微生物群和特定的N循环功能团的募集。

2 我们的结果表明，根际原核生物微生物群在自交系玉米的时间序列上发生了转移，与广泛的遗传亲缘关系（杂优群）无关（图2）。这些结论完全基于自交系玉米，不包括杂交系。我们决定只关注自交系，因为杂交玉米基因型表现出高度的杂种优势，并且典型地代表了不同杂种优势系的高度遗传多样性组合。这一点很重要，因为最近的研究已经证实，这种杂种优势可以对根际微生物群的组装产生相当大的影响。因此，以前的研究将杂交种包括在他们试图中来检验随着时间的推移选择效应对玉米的影响时，这在不知不觉中混淆了杂种优势和选择效应。需要进一步的研究来完全理清杂交如何影响玉米微生物群以及与农业可持续性相关的微生物功能的相互作用。

3 这些微生物群变化的后果延伸到根际中观察到的与氮循环相关的微生物基因的组成和丰度。我们发现在最近开发的种质中，由nifH表示的重氮菌的丰度和组成发生了变化。随着时间的推移，合成氮肥使用量的增加减少了玉米对微生物氮素供应的依赖。众所周知，维持地下共生性固氮是以碳成本为代价的，并改变了整个植物的地上碳分配。此外，改变养分的利用率会改变植物宿主组装微生物群的方式。在育种过程中，选择已根据谷物产量进行了调整，并削弱了地下碳分配。在玉米中的其他发现表明，一些地方品种具有更高的募集联合重氮菌的能力。携带固氮菌的玉米品系会产生特殊的富含碳的粘液分泌物来吸引这些微生物，并从这种相互作用中获得大量的植物可用氮。将碳资源分配到渗出物的生产是要付出产量成本的，在高氮条件下，不需要依赖重氮菌的固定氮，这削弱了维持原始玉米谱系中可能存在的营养共生关系的任何选择。此外，在持续的高氮施肥下，重氮菌可能进化成效率较低的互惠固氮菌。综合考虑这些因素，可以解释为什么几十年来的农作物选择会导致玉米重氮菌的募集发生变化。

4 通过种质时间序列，与反硝化和硝化作用相关的各种功能基因数量增加并改变了组成（图2C-F和表S5）。虽然并不是所有与这些过程相关的功能基因都对时间序列作出反应，特别是那些与反硝化作用相关的基因，但在时间和种质选择上仍有明显的模式。氮循环基因丰度的变化对于预测氮的损失和农业生态系统温室气体的产生可能很重要，因为进行反硝化和硝化作用的微生物可以去除或改变植物可用氮的化学结构和移动性。玉米根部特殊代谢物的选择性渗出可以解释硝化剂和反硝化剂在本研究中跨越种质的转移。例如，不同的谷物作物（高粱、水稻、小麦）都具有散发可抑制硝化生物代谢的次生植物化合物的能力。这里我们假设，近亲繁殖导致的种质多样性缩小可能已经侵蚀了复杂的代谢特征，这些特征对于形成与氮循环微生物类群的相互作用非常重要。玉米育种可能导致性状变化，从而影响不同品种吸收氮循环微生物的方式。越来越多的研究表明，植物可以驱动土壤生态系统中硝化菌和反硝化菌的变异性和活性。农业生态系统管理和作物育种改变了植物微生物群及其潜在功能，这表明植物-微生物群的相互作用在理论上是可变的，因此我们可以有意识地选择有助于保持养分、减少GHG产生和改善土壤健康的根际微生物群特征。

5 植物调节根际微生物酶的产生和宏基因组能力。在这里，我们预测了随着种质发展，微生物元基因组的变化。我们发现与氨基酸生物合成和有氧呼吸相关的基因途径的相对丰度增加。通过种质时间序列减少与氮底物降解相关的基因途径（图3和图4）。这些结果表明，在这个时间序列中，几十年前的植物支持土壤有机氮矿化的微生物群落，而后来的品系则相反。较新种质的根际微生物组富含具有更多的呼吸和氨基酸合成代谢途径的微生物类群。预测的元基因组结果表明，更多现代种质所募集的微生物群处于生长和生物合成状态。巧合的是，还预测这些现代微生物群具有较低的矿化游离有机氮源的能力；我们假设它们是从无机肥料中获得氮用于生物合成，从而潜在地与植物竞争营养，而不是相互合作。向有氧呼吸和简单糖分解的转变可能表明，较新的玉米品系正在募集富营养生物。地下微生物代谢的这些变化可以解释观察到的常规农业生态系统和有机农业生态系统之间的产量差距。吸收较少营养矿化微生物的玉米品系可能会因为通过有机氮源获得氮而受到损害，导致产量较低。目前，尚不确定哪种土壤代谢能理想地实现我们的可持续发展目标。然而，这些结果表明，我们可以培育种质来募集具有与土壤管理实践一致特征的微生物。

总之，工业化育种实践和农艺管理方法已在分类学和功能基因组水平上改变了玉米与其根际微生物群的相互作用。这些微生物群的差异可能会改变植物品种间的氮加工和整个农业生态系统中氮的移动。这些变化可能是因为对地上性状的强烈选择和合成氮肥的用量增加，减少了对微生物介导的氮循环过程的依赖。现代农业实践扰乱并加速了反应性氮循环。玉米是造成这一全球混乱的主要因素，因为它是世界上种植和施肥最多的作物之一。通过募集不同种类的氮循环类群和预测在不同年代发育的玉米种质的根际微生物组中的代谢途径反映了植物微生物群功能的改变。现代农业实践在50多年的时间里完成了玉米与根部微生物群相互作用的改变。根据这些观察结果，下一步将是确定微生物群募集的差异是否有助于农业生态系统的不可持续结果，以及这种微生物群募集的不可持续方面是否可逆。将微生物组及其功能作为植物基因组的扩展表型进行研究，将是优化农业系统以实现可持续性的必要步骤。

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