原名：Enteroendocrine cells sense bacterial tryptophan catabolites to activate enteric and vagal neuronal pathways

译名：肠内分泌细胞感知到细菌色氨酸分解代谢，激活肠道和迷走神经通路

期刊：Cell Host & Microbe

研究框架图

1、Edwardsiella tarda通过Trpa1激活EECs

为了在活体动物中识别激活EECs的刺激物，本文先开发了一种转基因斑马鱼系，通过在neurod1启动子的控制下表达EEC中的钙调节光激活比率（CaMPARI）蛋白来记录EEC的活性（图1A）。当暴露在405nm光下时，CaMPARI蛋白不可逆地从发射绿光的构型光转换为发射红光的构型，其构型转换与细胞内[Ca²⁺]_i水平正相关。CaMPARI蛋白显示红色和显示绿色的比值越大，反映了细胞内钙水平含量越高。因此，该EEC-CaMPARI系统能够在活体自由游泳动物的完整生理背景下成像肠EECs的钙活性记录（图1A、1B）。为了测试这个EEC-CaMPARI系统的有效性，首先用已知能激活斑马鱼EECs的不同营养物质刺激斑马鱼幼虫。仅暴露于水作为载剂对照，显示出预期的低基础浓度红色：绿色CaMPARI比率（图1C、1E和1F）。在用亚油酸和长链脂肪酸同时刺激后，一个EECs亚群表现出较高的活性红色：绿色CaMPARI比率（图1D-1F）。EECs红色：绿色CaMPARI比率很大被归类为激活的EECs。对已知的化学刺激（包括亚油酸、油酸、月桂酸盐和葡萄糖）激活EECs的百分比显著增加，但对短链脂肪酸丁酸盐没有反应，这与先前的发现一致（图1F）。

接下来应用EEC-CaMPARI系统来监测EECs是否对活体内的活细菌刺激有急性反应。将Tg（neurod1:CaMPARI）斑马鱼暴露于斑马鱼饲养水中的单个菌株中20分钟，然后进行光转换和CaMPARI荧光成像。在这些实验中，本文选择了11种细菌菌株，包括3种模式菌种（铜绿假单胞菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）、7种从斑马鱼肠道分离的共生菌株和致病菌Edwardsiella tarda FL6-60（图1K）。在这个显色系统中，唯一能产生红色：绿色EEC-CaMPARI信号的是E.tarda（图1G-1K）。进一步证实，利用另一种基于钙敏感荧光蛋白Gcamp6f（neurod1:Gcamp6f）的EEC活性报告显示，E.tarda直接激活EECs（图1L）。

图1 E.tarda在体内激活斑马鱼EECs。（A）测定自由游泳斑马鱼脑电活动的实验方法。（B）在EEC-CaMPARI模型中记录EEC对化学和微生物刺激物反应的方法。（C和D）紫外光转化后，水（C，阴性对照）或亚油酸（D）刺激Tg（neurod1:CaMPARI）时中肠EECs的反应。（E）EECs的显色分布红色：绿色CaMPARI在水中或亚油酸刺激斑马鱼的荧光强度比。（F）Tg（neurod1:CaMPARI）斑马鱼的EEC反应百分比。（G和H）紫外线光转化后，在Tg（neurod1:CaMPARI）中，Aeromonas sp.（G）或E.tarda（H）刺激中肠EECs的显色。（I）EECs的显色分布红色：绿色CaMPARI斑马鱼用水或E. tarda处理后的荧光强度比。（J） 代表性热图显示Aeromonas sp.，B. subtilis和E.tarda红色：绿色CaMPARI的荧光比。（K）不同菌株刺激斑马鱼Tg（neurod1:CaMPARI）的EECs激活。（L）用E.tarda刺激斑马鱼肠道的代表性Tg（neurod1:Gcamp6f）。

EECs可以表达多种感受器，这些感受器可以被不同的环境刺激所激活。为了研究EECs感知E. tarda菌刺激的机制，从斑马鱼幼虫中分离EECs并进行RNA-Seq分析。将按照FACS分类的EECs（cldn15la:EGFP+；neurod1:TagRFP+）中的转录水平与所有其他肠上皮细胞（IEC）（cldn15la:EGFP+；neurod1:TagRFP-）进行比较（图2A）。用P_FDR<0.05鉴定了192个斑马鱼转录物，这些转录物通过DESeq2在EECs中显著富集（图2B）。基因本体分析表明，这些斑马鱼基因在激素分泌、化学突触传递和神经肽信号转导等过程中具有丰富的功能。为了鉴定斑马鱼和哺乳动物中富含EECs的基因同源物，将这192个基因与已发表的小鼠十二指肠Neurod1+ EECs和人空肠CHGA+ EECs的RNA测序数据进行了比较。尽管存在进化距离和组织起源的差异，发现24%的斑马鱼EEC富集基因同源物（192个中的46个）在斑马鱼、人和小鼠之间共享，40%的斑马鱼EEC富集基因（192个中的78个）在斑马鱼EECs和人空肠EECs之间共享。具有保守EEC表达的基因包括编码激素、转录因子、G蛋白偶联受体和调节膜电位的离子通道的基因（图2C）。利用已发表的小鼠肠上皮单细胞RNA-seq数据，揭示了不同的EEC亚型，发现通过5-HT合成鉴定的小鼠肠嗜铬细胞（EC）中的许多特征基因在斑马鱼EECs中富集。在这些富含EEC的保守基因中，斑马鱼EECs中表达最高的基因之一瞬时受体电位通道锚蛋白A1（Trpa1）（图2C）。

Trpa1是一种兴奋性钙通道蛋白，在痛觉和神经系统疾病中具有重要作用。广泛的化学刺激物，包括AITC和其他从食品香料中提取的化合物，能激活Trpa1。除了化学刺激物，某些细菌产物，包括脂多糖（LPS）和硫化氢（H₂S），以Trpa1依赖的方式刺激伤害性神经元。斑马鱼基因组编码两个trpa1同源序列trpa1a和trpa1b。本文的数据证实，trpa1b而不是trpa1a由斑马鱼EECs的一个子集表达，并且是Trpa1激动剂AITC激活EEC所必需的（图2D-2F）。由于经典微生物模式识别受体在斑马鱼EEC中的表达非常低，本文测试了Trpa1介导的E.tarda是否诱导EEC激活。首先观察到野生型（WT）Tg（neurod1:CaMPARI）斑马鱼的处理用Trpa1拮抗剂HC030031显著抑制E.tarda诱导EEC激活的能力（图2G-2J）。在EEC-CaMPARI模型中，E.tarda诱导EEC活性的能力在trpa1b突变斑马鱼中同样被阻断（图2K-2N）。与此一致，在Tg（neurod1:Gcamp6f）斑马鱼中的实验证实，Gcamp6f荧光在EEC中增加，以响应WT中的E.tarda刺激，但在trpa1b突变斑马鱼中不增加（图2O-2R）。因此，活的E.tarda细菌以Trpa1依赖的方式刺激EECs，提示EEC Trpa1信号可能在介导微生物-宿主相互作用中起重要作用。

图2 E.tarda通过Trpa1激活EECs。（A）斑马鱼EEC的RNA-seq示意图。（B）斑马鱼EECs在其他IECs中显著富集的基因簇。（P_adj < 0.05）（C）斑马鱼和小鼠EEC富集基因的比较。（D）TgBAC的荧光图像（trpa1b:EGFP）。放大显示trpa1b细胞在肠道中的表达。（E）TgBAC（trpa1b:EGFP）；Tg（neurod1:TagRFP）斑马鱼肠的激光共聚焦投影。黄色箭头表示是trpa1b:EGFP+的斑马鱼EECs。（F）trpa1b+/+、trpa1b+/-和trpa1b-/-斑马鱼对Trpa1激动剂AITC刺激的EEC-Gcamp6f反应的定量研究。（G）实验设计。（H和I）用（H）或不用Trpa1拮抗剂HC030031（I）刺激的E. tarda菌刺激的Tg（neurod1:CaMPARI）斑马鱼肠道的激光共聚焦投影。（J）对照组和HC030031处理的斑马鱼中活化EECs的定量，用水或E.tarda处理。（K）实验方法。（L和M）用E.tarda刺激后trpa1b+/+（L）或trpa1b-/-（M）Tg（neurod1:CaMPARI）肠的激光共聚焦投影。（N）水或E.tarda处理的WT和trpa1b-/-斑马鱼中活化EEC百分比的定量。（O）实验设计。（P和Q）用E.tarda刺激的trpa1b+/+（P）或trpa1b-/-（Q）Tg（neurod1:Gcamp6f）斑马鱼的定时图像。（R）用E.tarda处理trpa1b+/+或trpa1b-/-斑马鱼的相对EEC-Gcamp6f荧光强度的定量。

2、EEC Trpa1信号通过调节肠道运动来维持微生物的稳态

为了确定E.tarda在EECs中诱导的Trpa1信号如何影响宿主，将trpa1b+/+和trpa1b-/-斑马鱼幼虫暴露于表达mCherry荧光蛋白的E.tarda菌株中。高剂量（10⁷ CFU/mL）暴露于E.tarda 3天可降低存活率并引起病理改变。为了研究在相对正常的生理条件下E.tarda和Trpa1+EECs之间的相互作用，用低剂量E.tarda（10⁶ CFU/mL）暴露斑马鱼，该剂量不会显著影响存活率或引起病理学（图3A）。在常规条件下，在没有E.tarda的情况下影响时，观察到trpa1b+/+和trpa1b-/-斑马鱼之间可培养肠道微生物的丰度没有显著差异。然而，在用E.tarda处理3天后，trpa1b-/-幼虫的肠腔中有显著的E.tarda mCherry+细菌累积，而不是trpa1b+/+幼虫（图3A-3C）。这种聚集可以通过定量肠E.tarda mCherry荧光（图3D）或从经E.tarda处理的trpa1b+/+和trpa1b-/-斑马鱼的消化道分离的E.tarda CFUs计数来观察（图3E）。这表明Trpa1信号可能作为一种宿主防御机制，促进特定类型细菌如E.tarda的清除。

除EECs外，Trpa1还表达于肠内的间充质细胞（图2D、2E）和伤害性感觉神经元。为了测试观察到的上述表型是否由EECs特异性介导，本文构建了一个Cre-loxP转基因系统，该系统允许特异性切除EECs，而不影响其他IECs或其他neurod1表达细胞，如中枢神经系统（CNS）或胰岛（图3F）。RT-PCR和免疫荧光证实EEC激素减少，但非EEC标记基因没有减少。建立这个消除EEC系统可以明确EECs在介导E.tarda-宿主间的相互作用。与trpa1b-/-斑马鱼一样，本文没有检测到未暴露WT和去除EEC了的斑马鱼肠道微生物丰度的显著差异。然而，与WT同胞对照组相比，在暴露于E.tarda的情况下，去除EEC的斑马鱼中积累的E.tarda mCherry数量显著高于WT同胞对照组（图3H）。总之，这些数据证实了EEC Trpa1信号通过促进宿主清除特定类型的细菌（如E.tarda）来维持肠道微生物的稳态。

图3 激活EEC Trpa1信号促进肠道E.tarda菌清除（A）用E.tarda处理斑马鱼示意图。（B和C）用表达mCherry的E.tarda处理的trpa1b+/+（B）或trpa1b-/-（C）斑马鱼的代表性图像（E.tarda mCherry）。（D）trpa1b+/+或trpa1b-/-斑马鱼肠道中E.tarda mCherry荧光定量。（E）trpa1b+/+或trpa1b-/-斑马鱼肠道E.tarda CFU的定量分析。（F）通过Cre诱导的白喉毒素（DTA）表达清除EECs的遗传模型示意图。（G）Tg（neurod1:cre；cmlc2:EGFP）和Tg（neurod1:cre；cmlc2:EGFP）；TgBAC（gata5:RSD）与Tg（neurod1:EGFP）标记的EECs的代表性图像。（H）WT或去除EEC了的斑马鱼肠道E.tardaCFU的定量分析。

为了了解EECTrpa1调节肠道微生物内稳态的机制，本文使用了一种光药理学方法，通过紫外线照射对EEC Trpa1激活进行时间控制（图4A）。用Optovin对斑马鱼进行了预处理，Optovin是一种只在紫外光下特异性激活Trpa1的化学物质。为了激活EECs中的Trpa1，用激光将经过Optovin预处理的斑马鱼幼虫和限制紫外光照射到肠上皮上。用Gcamp6f荧光法测定，紫外光激活显著增加了WT幼虫EECs亚群的[Ca²⁺]_i。在用Optovin预处理的trpa1b-/-幼虫中相同的紫外光暴露没有增加EEC [Ca²⁺]_i（图4B和4C），表明Optovin-UV诱导的EEC激活依赖于Trpa1。接下来，用这种方法来检测EEC Trpa1激活对肠道运动的影响。在WT幼虫中，通过紫外线照射激活中肠内EEC中的Trpa1，使肠从前向后推进，肠道运动速度相应增加（图4D-4F；视频1）。相反，在去除EEC了的斑马鱼中，Optovin处理和UV激活未能诱导肠道运动（图4D-4F；视频1）。这些结果表明Trpa1激活引起的肠道运动依赖于EECs。为了进一步测试来自Trpa1 EECs的信号是否足以激活肠道运动，本文开发了一种光遗传学系统，其中mCherry标记的通道视紫红质（ChR2-mCherry）在来自neurod1启动子的EECs中表达（图4G和4H）。ChR2的蓝光激活引起阳离子内渗和质膜去极化，然后[Ca²⁺]_i通过电压依赖性钙通道的激活而增加，这些钙通道在斑马鱼EEC中大量表达（图4I-4J）。该工具允许使用激光共聚焦激光选择性激活ChR2-mCherry EEC，而不影响附近EEC的活性。因此使用Tg（neurod1:Gal4）；Tg(UAS:ChR2-mCherry)；TgBAC（trpa1b:EGFP）幼虫选择性激活表达trpa1b+或trpa1b-的EECs。发现trpa1b+ EECs的激活而不是trpa1b- EECs的激活持续增加肠道速度幅度（图4K、4L；视频2），再次表明Trpa1EECs在调节肠道运动中的独特作用。Optovin-UV的结果显示，刺激中肠Trpa1 ChR2 EECs导致顺行肠道运动（视频2）。

有趣的是，在近端肠刺激Trpa1-ChR2-EECs启动了肠逆行运动。这与先前的研究结果一致，斑马鱼的近端肠通常表现为逆行运动模式，而中段和远端肠则表现为顺行运动。最后，本文测试了微生物激活的Trpa1信号在EEC中是否也增加了肠动力。使用微灌胃法，发现与PBS灌胃对照组相比，将活的E.tarda送入肠腔显著促进肠蠕动和运动（图4M-4O；视频3）。E.tarda在trpa1b-/-斑马鱼中诱导的肠道运动性显著降低。用Aeromonas或Bacillus（两种不激活EECs的受试菌株）灌胃斑马鱼时（图1），未观察到肠道运动的显著变化（图4M-4O；视频3）。这些实验共同证实了在EECs中Trpa1的激活直接刺激肠运动，并提供了一个潜在的生理机制，使E.tarda从肠腔中清除Trpa1依赖性。

图4 激活EEC Trpa1信号促进肠道运动（A）使用Optovin-UV平台激活EEC Trpa1的图示。（B）紫外线激活前后trpa1b+/+和trpa1b-/- Tg（neurod1:Gcamp6f）斑马鱼EECs的激光共聚焦图像。（C）紫外线诱导前后trpa1b+/+和trpa1b-/-斑马鱼中EEC-Gcamp6f荧光变化的定量研究。（D）紫外线诱导Trpa1激活前后斑马鱼肠道Tg（neurod1:Gcamp6f）的典型图像。黄色箭头表示EEC激活后肠腔内容物从前向后移动。（E）用PIV-Lab速度分析来定量WT和EEC斑马鱼的肠道运动。热图代表Trpa1激活后指定时间点成像肠段的速度。（F）WT和EEC消融斑马鱼紫外线激活前后平均肠道速度的定量研究。（G）EECs中ChR2的光激活模型。（H）荧光图像Tg(neurod1:Gal4);Tg(UAS:ChR2-mCherry)在EEC中表达ChR2的斑马鱼。（I）蓝光诱导ChR2激活前后Tg（neurod1:Gcamp6f）肠内ChR2表达EECs的激光共聚焦图像。（J）蓝光诱导ChR2活化前后EEC-Gcamp荧光强度的定量分析。（K）蓝光激活ChR2+Trpa1+EECs前后的肠道速度幅度。（L）蓝光激活ChR2+Trpa1+EECs前后的平均速度幅度。（M）（N）和（O）的实验设计示意图。（N）热图表示Aeromonas sp.或E. tarda灌胃后指定时间点成像肠段的速度。（O）未灌胃或灌胃PBS或不同菌株斑马鱼的平均肠道速度幅度。

3、EEC Trpa1信号通过激活肠胆碱能神经元促进肠道运动

为了测试肠内神经系统（ENS）在Trpa1激活的肠道运动中的作用，本文使用了由受体酪氨酸激酶基因ret突变而缺乏ENS的斑马鱼。免疫荧光显示ret-/-斑马鱼缺乏所有可识别的肠神经（由NBT转基因标记，图5B），而EECs保持完整（由neurod1转基因标记，图5B），并对Trpa1激动剂有反应。使用Optovin-UV系统（图5A），观察到EEC Trpa1激活增加了肠道运动对照组（ret+/+或ret+/-），但不是ret-/-斑马鱼（图5C、5D）。这些结果是用第二个斑马鱼突变体证实的，该突变体由于转录因子基因sox10的突变而缺乏ENS。这些数据表明Trpa1 EECs不直接向肠平滑肌发出信号以促进肠运动，而是向肠平滑肌发出信号。

ENS是一个由许多不同的神经元组成的复杂网络。在这些亚型中，胆碱能神经元分泌兴奋性神经递质乙酰胆碱以刺激其他肠神经元或平滑肌，并且对正常肠道运动是必需的。胆碱乙酰转移酶（Chat）是ENS中合成乙酰胆碱的关键酶之一。使用TgBAC(chata:Gal4); Tg(UAS:NTR-mCherry)转基因斑马鱼，观察到斑马鱼肠道中的胆碱能神经元（图5E）。发现chata+神经元具有光滑的细胞体，位于肠壁内，其中许多显示多个轴突（图5E）。这种多极神经元也被归类为Dogiel Ⅱ型神经元。这些Dogiel Ⅱ型神经元可能是肠内初级传入神经元（IPAN）。本文的结果表明，一些EEC包括Trpa1+EEC与从chata+肠神经元延伸的神经纤维形成直接接触（图5F-5H）。此外，本文发现斑马鱼EEC富含编码突触前囊泡蛋白的转录物，并形成与小鼠EEC类似的与神经元连接的神经末梢结构。为了测试Trpa1+EECs的激活是否能刺激chata+肠神经元，采用TgBAC(chata:-Gal4);Tg(UAS:Gcamp6s)斑马鱼，允许记录chata+神经元的体内钙活性（图5I和5J）。Trpa1+EEC激活后，chata+肠神经元的Gcamp6s荧光增强（图5K和5L）。发现Trpa1在chata+肠道神经元或任何其他ENS细胞中不表达，这表明chata+肠道神经元不能直接被视Trpa1刺激激活，而是通过Trpa1+EECs刺激激活。除了ENS外，迷走传出神经在调节肠道运动中也起重要作用。然而，观察到类似的Trpa1+EEC诱导的肠道运动在解剖上与中枢神经系统断开连接的斑马鱼中的变化和chata+肠神经元激活，表明迷走神经传出神经不是Trpa1+EEC诱导的肠道运动所必需的，并且Trpa1+EEC诱导的肠道运动是由内在肠回路介导的，可能涉及到chata+肠神经元。

先前的小鼠研究表明，Trpa1 mRNA在小肠分泌5-HT的EC细胞中高度富集。免疫荧光染色表明，与哺乳动物类似，斑马鱼肠上皮中的5-HT表达也在Trpa1+EECs中高度富集（图5M）。EECs中的5-HT是由色氨酸经色氨酸羟化酶1（Tph1）合成的。斑马鱼有两个Tph1旁系，tph1a和tph1b，但只有tph1b在斑马鱼EECs中表达。通过将Tg(tph1b:mCherry-NTR)转基因系与TgBAC(trpa1b:EGFP)斑马鱼杂交（图5N），也证实了tph1b在Trpa1+EECs中的表达。为了研究5-HT是否介导EEC Trpa1诱导的肠道运动，使用Optovin-UV平台测试了tph1b+/+和tph1b-/-斑马鱼幼虫中是否存在类似的反应。在基线条件下，没有观察到tph1b+/+和tph1b-/-斑马鱼之间肠道运动的显著差异。然而，与tph1b+/+斑马鱼相比，在UV刺激的EEC Trpa1激活下，tph1b-/-斑马鱼的肠道运动性显著降低（图5O）。这些发现提示了一个工作模型，在这个模型中，Trpa1+EECs通过5-HT向肠胆碱能神经元发出信号，5-HT反过来刺激肠运动，促进肠运动。

图5 激活EEC Trpa1信号通过5-HT激活肠道胆碱能神经元并促进肠道运动。（A）显示Trpa1刺激EEC激活肠道神经元。（B）ret+/？（ret+/+或ret+/-）和ret-/-斑马鱼肠道的激光共聚焦图像。neurod1标记的EECs以绿色显示，NBT标记的ENS以洋红色显示。（C）ret+/？斑马鱼EECTrpa1激活前后平均肠道速度的定量研究。（D）ret-/-斑马鱼紫外线激活前后平均肠道速度大小的量化。（E）激光共聚焦图像显示斑马鱼肠道中的EECs（neurod1+；绿色）和肠胆碱能神经元（chata+；洋红色）。星号表示位于肠壁上的肠胆碱能神经元胞体。（F）高倍放大显示EECs（绿色）直接接触从chata+肠神经细胞体（品红）延伸的神经纤维，如黄色箭头所示。（G和H）激光共聚焦图像显示Trpa1+EECs（绿色）与chata+肠神经元（品红）形成直接接触。（I和J）肠胆碱能神经元的体内钙显像。所有的肠神经元都被标记为洋红色NBT：红色。黄色箭头表示表达Gcamp6s的chata+肠神经元。（K）EEC Trpa1激活前后chata+肠神经元的体内钙显像。（L）EEC Trpa1激活前后chata+肠神经元Gcamp6s荧光强度的定量研究。（M）TgBAC（trpa1b:EGFP）斑马鱼肠5-HT染色的激光共聚焦图像。黄色箭头表示trpa1b+EECs基底区存在5-HT。（N）激光共聚焦图像显示斑马鱼Trpa1b+EECs（绿色）表达Tph1b（品红）。（O）tph1b+/+和tph1b-/-斑马鱼对EEC Trpa1激活的肠道运动性变化的定量研究。

4、化学和微生物刺激EEC Trpa1信号激活迷走神经感觉神经节

在哺乳动物中，迷走神经的传入神经元胞体位于结状神经节中，从肠道到脑干传递内脏信息到中枢神经系统。然而，在斑马鱼中，迷走神经感觉系统是否支配肠道还不清楚。斑马鱼迷走神经感觉神经节可使用TgBAC（neurod1:EGFP）或神经元标记物乙酰化α微管蛋白（Ac-αTub）的免疫荧光染色进行标记（图6B）。利用光片显微镜成像，证明了斑马鱼的迷走神经神经节不仅延伸投射到肠道（图6B、6C），而且迷走神经感觉神经纤维也直接接触到一个EECs亚群（图6D）。利用Tg(neurod1:cre); Tg(b-act2:-Brainbow)转基因斑马鱼，其中单个迷走神经神经节细胞通过Cre重组被标记为不同的荧光颜色，本文发现斑马鱼迷走神经感觉神经节细胞也直接投射到迷走神经感觉神经节后脑区域（图6E和6F）。利用这个迷走神经脑系统，在近端和远端肠中发现了被Cre重组标记的迷走神经感觉神经。为了进一步观察斑马鱼的迷走神经感觉网络，使用Tg（isl1:EGFP）斑马鱼，其中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在迷走神经感觉神经节中表达，并与neurod1重叠（图6G）。数据显示，在离开迷走神经感觉神经节后，迷走神经沿着食道运动，进入胰腺和肝脏之间区域的肠道（图6G）。在Tg（isl1:EGFP）；Tg（neurod1:TagRFP）斑马鱼中也可以观察到EEC和迷走神经的直接接触（图6H）。这些数据表明斑马鱼肠道中存在迷走神经网络。

下一步研究了迷走神经网络是否在E. tarda的肠道微生物刺激下被激活。用PBS或活的E.tarda菌灌胃Tg（neurod1:Gcamp6f）；Tg（neurod1:TagRFP）斑马鱼幼虫。结果发现，在用Trpa1激动剂AITC或E.tarda进行肠内刺激30分钟后，而不是在PBS载体刺激后，迷走神经感觉神经元子集中的Gcamp6f荧光强度显著增加（图6I-6K）。这一结果表明，急性肠道化学或微生物刺激直接激活迷走神经感觉神经元。为了进一步研究肠道E.tarda诱导的迷走神经激活是否由Trpa1+EECs介导，通过pERK+免疫荧光标记活跃的斑马鱼神经元来测量迷走神经活性。与PBS处理相比，通过微灌胃将AITC送入斑马鱼肠道增加了pERK+迷走神经细胞的数量（图6L-6N和6R）。在没有EECs的情况下，AITC诱导的迷走神经激活被消除（图6N和6R），这表明肠中的Trpa1信号在正常情况下增加了EEC依赖的方式增加迷走神经感觉活动。接下来，灌胃活的E.tarda到两个地方，并用EEC刺激斑马鱼。与Trpa1化学激动剂刺激类似，E.tarda灌胃增加了野生斑马鱼（图6O-6Q和6S）中激活的pERK+迷走神经感觉神经元的数量，但在EEC刺激的斑马鱼中没有增加（图6Q和6S）。此外，肠内E.tarda诱导的迷走神经激活依赖于Trpa1，因为E.tarda处理的trpa1b-/-斑马鱼的pERK+迷走神经细胞数量显著减少（图6T）。总之，这些结果表明，肠道内的化学或微生物刺激可刺激Trpa1+EECs，然后向迷走神经感觉神经节发出信号。

图6 EECTrpa1信号激活迷走神经感觉神经节。（A）作用机制。（B）Tg（neurod1:EGFP）（绿色）和AC-αTub抗体染色（品红）标记斑马鱼迷走神经感觉神经节的激光共聚焦图像。（C）斑马鱼AC-αTub染色的光片投影。黄色箭头表示迷走神经支配肠道。（D）neurod1:EGFP+EECs（绿色）直接接触αTub（白色）标记的迷走神经感觉神经纤维。（E）斑马鱼幼体迷走神经感觉核的激光共聚焦图像迷走神经感觉神经元投射的后脑。在Tg（neurod1:Cre）；Tg（bact2:brainbow）斑马鱼中，通过Cre-brainbow重组，迷走神经感觉神经纤维被不同的荧光载体标记。利用mapzebrain软件生成了斑马鱼脑的三维图像。（F）斑马鱼迷走神经感觉神经节的激光共聚焦图像。星号表示后侧线传入神经纤维。蓝色箭头表示迷走神经感觉神经节的三个分支投射到后脑。（G）激光共聚焦图像显示斑马鱼肠道的EEC迷走神经网络。EECs被neurod1:TagRFP标记为洋红色，迷走神经被isl1:EGFP标记为绿色。（H）EECs（neurod1；洋红色）直接接触迷走神经纤维（isl1；绿色），如黄色箭头所示。（I和J）用PBS（I）或E.tarda（J）灌胃斑马鱼迷走神经感觉神经节的体内钙显像。（K）用E.tarda或PBS灌胃斑马鱼个体迷走神经感觉神经元Gcamp6f荧光强度的定量研究。（L-N）用pERK+抗体（激活的迷走神经感觉神经元；洋红）染色的迷走神经神经节（neurod1；绿色）的共焦图像，用PBS（L）或Trpa1激动剂AITC（M，N）灌胃的WT（L，M）或EEC消融的斑马鱼（N）。（O-Q）用pERK抗体染色的迷走神经神经节的共焦投影在WT（O，P）或用PBS（O）或E.tarda（P，Q）灌胃的EEC的（Q）斑马鱼中。（R）PBS或AITC灌胃后WT或EEC消融斑马鱼pERK+迷走神经感觉神经元的定量研究。（S）PBS或E.tarda灌胃后WT或EEC消融斑马鱼pERK+迷走神经感觉神经元的定量研究。（T）WT或trpa1b-/-斑马鱼灌胃E.tarda后pERK+迷走神经感觉神经元的定量研究。

5、E. tarda分泌的色氨酸分解代谢产物激活EEC Trpa1肠-脑通路

为了确定E.tarda激活EEC中Trpa1的分子机制，检测了活的和杀死的E.tarda细胞和无细胞上清液（CFS）对EEC钙活性的影响（图7A）。福尔马林杀死或热杀死的E.tarda细胞未能刺激EECs，然而，CFS在与活E.tarda相当的水平上刺激EECs（图7A和7B）。在trpa1b突变斑马鱼中，E.tarda CFS激活EECs的能力减弱（图7C），这表明E.tarda分泌的因子具有激活EECs中Trpa1的能力。HPLC-MS分析显示，E.tarda CFS富含几种含有吲哚环的色氨酸分解代谢产物（图7D），其中三种最丰富的是吲哚、色氨酸（IEt）和吲哚-3-甲醛（IAld）（图7D）。为了测试其他细菌是否分泌色氨酸分解代谢产物，如E.tarda，对先前测试EEC激活的细菌的CFS进行了类似的HPLC-MS分析（图1K）。尽管在营养丰富的培养基中培养时，有几种受试菌株产生吲哚或IAld，但当在斑马鱼在生活水中培养时，E.tarda是唯一保持高水平吲哚和IAld产生的细菌（图7E），这与本文的发现相一致，即当加入GZM水中（图1K）。为了研究这些色氨酸代谢物是否与E.tarda的发病机制直接相关，测试了另外两株从人类肠道微生物群中分离出来的不会引起鱼类的E.tarda菌株（E.tarda 23685和E.tarda 15974）发病。两种E.tarda菌株均激活EECs，并表现出与致病性E.tarda FL6-60和E.tardaLSE40相似的吲哚和吲哚乙酸分泌能力（图7E）。这一结果表明，色氨酸分解代谢产物的产生、EEC Trpa1的激活及其下游结果可能与E.tarda病（Edwardsiellosis）的发病机制不同。

接下来测试了E.tarda色氨酸分解代谢产物是否足以激活EECs。吲哚和IAld，而不是其他测试色氨酸分解代谢产物，以TRPA1依赖的方式强烈激活斑马鱼EEC（图7F、7G）。吲哚和IAld也激活转染到HEK细胞的人TRPA1受体（图7H-7J）。吲哚和IAld均表现出完全的TRPA1激动剂活性，其效率与肉桂醛（CAD）相当，肉桂醛是一种特性良好的TRPA1激活剂（图7I、7J，视频4）。吲哚和IAld也能激活小鼠Trpa1，但作用较弱。吲哚和吲哚诱导的人和小鼠Trpa1激活均被Trpa1抑制剂A967079阻断（图7J）。这些结果表明，微生物色氨酸分解代谢产物吲哚和吲哚是脊椎动物TRPA1进化上保守的激动剂。

接下来，研究了吲哚和IAld是否可以模拟活的E.tarda刺激，并通过EEC Trpa1信号激活类似的肠-脑通路。结果表明，通过微灌胃肠道输送吲哚或IAld可增加迷走神经感觉神经元亚群的Gcamp6f荧光（图7K-7O），并且用吲哚刺激斑马鱼幼虫可增加肠道运动。这种由肠道吲哚诱导的迷走神经感觉神经元激活在缺乏EEC的斑马鱼幼虫中被消除（图7K-7O）。为了测试微生物色氨酸代谢物诱导Trpa1+EEC信号传导的能力是否在哺乳动物中是保守的，在人和小鼠小肠新鲜组织切片上来测量急性吲哚暴露对5-HT分泌的影响。事实上，吲哚能够显著诱导人和小鼠的5-HT分泌，这种作用被Trpa1抑制剂HC030031阻断（图7P和7R）。表明，这些微生物色氨酸分解代谢可能调节肠道运动和肠脑沟通的人。

图7 E.tarda色氨酸分解代谢激活Trpa1和EEC迷走神经通路。（A）从E.tardaGZM（斑马鱼水）培养物制备不同组分的方法。（B） 不同的E.tarda组分刺激Tg（neurod1:CaMPARI）斑马鱼激活的EECs。（C）用E.tarda CFS刺激的trpa1b+/+和trpa1b-/- Tg（neurod1:CaMPARI）斑马鱼中激活的EECs。（D）LCMS测定在GZM培养基中筛选E.tarda的上清液。在0、1、6和24小时收集样品。（E）在GZM培养基中培养1天的各种共生细菌上清液中Trp吲哚衍生物的化学特征。（F）吲哚或IAld刺激斑马鱼的Tg（neurod1:Gcamp6f）。肠内激活的EEC用白色箭头标记。（G）吲哚或IAld诱导的trpa1b+/+和trpa1b-/-斑马鱼中EEC Gcamp活性的定量。（H）吲哚和IAld对人或小鼠Trpa1影响的实验设计示意图。（I）在表达TRPA1的HEK-293T细胞中，作为吲哚和IAld浓度函数的基线以上综合钙荧光反应的剂量反应分析。（J）A967079对吲哚和IAld诱导的钙中毒的剂量反应分析。（K-N）用WT（K-M）或EEC消融（N）Tg（neurod1:Gcamp6f）；Tg（neurod1:TagRFP）斑马鱼灌胃PBS（K）、吲哚（L，N）或IAld（M）的迷走神经感觉神经节的体内钙显像。（O）用PBS或1 mM吲哚灌胃WT或EEC烧蚀斑马鱼，定量测定单个迷走神经感觉神经节细胞Gcamp6f荧光强度。（P）检测吲哚对小鼠和人小肠组织5-HT分泌影响的安培测量示意图。（Q）吲哚可显著增加小鼠十二指肠5-HT的分泌，但在Trpa1拮抗剂HC030031存在时，未观察到这种作用。（R）吲哚可显著增加回肠5-HT的分泌，但在Trpa1拮抗剂HC030031的作用下未观察到这种作用。

（1）微生物衍生的色氨酸分解代谢产物通过Trpa1与宿主相互作用。本文的结果表明，由产生高水平色氨酸分解代谢产物的细菌（如E.tarda）的肠道定植导致Trpa1 EECs感受到这些分解代谢产物，从而导致通过增加的肠道运动清除这些细菌。但在斑马鱼的水体条件下，没有一种被测试的斑马鱼共生菌表现出产生和分泌色氨酸分解代谢产物的高能力。由于没有在这些实验条件下检测到用E.tarda处理的斑马鱼的明显发病机制，并且由于许多E.tarda诱导的反应是通过吲哚或IAld单独重现的，推测本文报道的EEC Trpa1激活及其下游结果与E.tarda诱导的发病机制是分离的，并且与肠道中的宿主微生物关系具有更广泛的相关性。

（2）肠道微生物群-EEC-ENS-信号通讯和交流。肠道微生物群是否调节小肠5-HT的分泌和信号传导尚不清楚。本文的数据提出了一个模型，其中特定的微生物群落或组成物种刺激Trpa1 EEC分泌5-HT，通过产生色氨酸分解代谢来调节小肠运动。这可能提供了肠道微生物群调节小肠5-HT信号传导的机制。吲哚、吲哚等色氨酸分解代谢产物是由多种肠道细菌产生的，因此本文的研究结果有望应用于共生菌和病原菌及其与宿主的相互作用。

（3）肠道微生物群-EEC-CNS-信号通讯和交流。本文的研究结果表明，除了脊髓感觉神经外，EEC迷走神经信号是一个重要的途径，将特定的肠道微生物信号传递到中枢神经系统。迷走神经神经节直接投射到后脑，迷走神经后脑通路在食欲和代谢调节中起着关键作用。本文的发现增加了某些色氨酸分解代谢产物，包括吲哚，可能直接影响这些过程以及情绪行为和认知功能的可能性。如果是这样，这通路可用于治疗肠道微生物群相关的神经系统疾病。