原名：Unraveling the riverine antibiotic resistome: the downstream fate of anthropogenic inputs

译名：阐明河流抗生素耐药基因组：人为输入的下游归趋

期刊：Water Research

IF：9.130

发表时间：2021.3.15

通讯作者：Helmut Bürgmann

通讯作者单位：瑞士联邦水科学和技术研究所（EAWAG）

本文在瑞士的苏士河（Suze）和穆尔格河（River Murg）各选定了一个河段，每个河段内只有一个排污口，河段上游没有已知的排污口。在2018年7月09日（VIL1）、7月19日（VIL2）、7月30日（VIL3）和11月05日（VIL4）对苏士河进行了4次采样，2018年7月26日（MUE1）、8月03日（MUE2）和8月06日（MUE3）对穆尔格河进行了3次采样。并采集了污水处理厂排出的污水，记为EF。

温度、电导率、pH、溶解氧等物理化学指标在取样时及时测量，为了减少流速对实验结果的影响，本文进行了投盐法示踪试验。为了提供对环境中抗生素耐药性指标的全面评估，我们结合了多种方法：在含有抗生素的培养基上培养异养细菌，通过qPCR定量人为来源的抗生素耐药基因的关键指标，以及使用鸟枪法宏基因组测序对所选样品中的耐药基因组进行广泛分析。同时本文还利用化学分析方法测量了样品中的金属、离子、营养物质和溶解的有机碳；利用保守示踪剂等物理方法对稀释效应、河流流量进行了探究计算。

1 上游水质及污水处理厂排污量

除了在MUE2观察到ermB和intl1的水平升高，污水处理厂上游的intI1和目标ARGs的拷贝数普遍较低。无论是VIL还是MUE，化学水质同样没有发现来自支流或上游的显著污染输入，大多数微量污染物均低于最低定量浓度。偶尔能检测到浓度很低的某些微量污染物。对于可培养的多药耐药菌，特别是对CLR/TET耐药菌，在VIL2和MUE2-US样品中观察到较高的上游值。这些研究结果表明，虽然没有指示出明显的上游污染，但一些可能来自城市或农业周期性活动的污染可能会影响河流。在污水处理厂的上游存在定居点和畜牧活动。虽然我们假设来自农业位点的地表径流最小，因为我们的取样是在干旱天气条件下进行的，但不能排除一些农业活动的投入会偶然性影响河流。本项目未对这些瞬时微生物污染的性质进行进一步的研究，但未来的工作可采用微生物源追踪或微生物指纹技术来确定其来源。

两个污水处理厂的废水都含有相当多的污染物。例如，钠的排出浓度比上游水平高约1个数量级，ARGs和intI1的排出浓度比上游水平高1-2个数量级，微量污染物的排出浓度比上游水平高2个数量级。这些结果与之前一项针对瑞士河流中微量污染物的大规模研究一致。

2 下游河流抗生素耐药决定因素的短距离归趋

重点是污水处理厂废水的直接影响，污水处理厂废水对VIL和MUE的排污河流都产生了显著的影响。用电导率法估算了污水在下游接收水体中所占的比例，VIL1~4为10.5 ~ 35.9%，MUE1~3为33.0 ~ 38.0%。因此，与US相比，在D1 qPCR定量的sul1、ermB、tetW和intI1基因拷贝数显著增加（P<0.01配对t检验）。然而，在VIL和MUE中，这些抗生素耐药性指示基因的测量水平分别在下游2.5公里和2公里处（D2或D3位置）迅速下降至接近上游水平。

多药耐药细菌中也表现出了相同的的动态变化，特别是CLR/TET耐药菌。SMX/TMP/TET耐药性通常低于检出限（5.0 CFU/mL），但在D1样品中的明显高于检出限，因此也高于下游。

有几个过程可能使耐药性决定因素减少，包括地下水或支流输入水的稀释作用，生物退化（如因阳光照射、环境温度降低、捕食等导致细胞死亡或休眠）和细胞沉积。

3 稀释效应强烈地影响废水抗性决定因素的短距离动态

为了确定稀释作用的重要性，我们根据保守的化学示踪剂浓度（例如，钠，4/5甲基苯并三唑、卡马西平）比较了污水处理厂排污点（VIL为DP_D1-2；MUE为DP _D1-3 ）下游短距离内计算的DP值（VIL为DI到D2；MUE为D1 到D3）以及ARG和intI1水平。靶点抗生素耐药性指示基因DP_D1-2/3的水平始终高于保守示踪剂，提示可能存在潜在的拷贝数减少机制。然而，在“稀释参数在不同生物和保守指标间无显著差异”的零假设下，采用配对t检验，只有sul1和tetW与钠之间的存在显著差异，P<0.05（P经Benjamini-Hochberg法校正），证实了非保守行为和额外的拷贝数减少机制。由于钠的DP_{D1-2 /3}占了sul1和tetW值的很大一部分，钠定量的稀释效应解释了这些参数的浓度下降的主要原因。这一结果表明，污水中耐药性决定因素拷贝数水平一到污水处理厂下游就迅速下降主要是稀释作用的影响。因此在研究耐药性决定因素的环境归趋时，稀释效应需要仔细考虑，为了准确评估环境归趋，需要确定拷贝数而不是浓度。

4 在下游更远的距离，存在额外源/汇的显著影响

我们假设，在更远的距离上，额外的源/汇机制会影响抗生素耐药性指示基因的下游动态。为了更详细地分析这一点，通过将阻力水平与每个位置的流量相乘，计算出目标ARGs和intI1在排放点的每日负载，以及下游远近距离的负载，然后进行比较。流量可以直接从附近的测量站获得，也可以考虑以钠为指标的污水流量，并根据质量守恒假设下推导的方程进行估算。

目的抗生素耐药性指示基因的下游动态因指标和采样而异。例如，所有样本的ermB和tetW基因拷贝数从废水排放到最远的下游位点下降明显且一致。超过13.7km距离的VIL1~4，基因ermB和tetW平均拷贝数减少81±17%，70±15%；超过6.8km距离的MUE1~3，基因ermB和tetW平均拷贝数减少95±5%，96±2%。相反，基因sul1拷贝数的下游动态在采样期间是不一致的。VILI ~4随距离显著减少，但MUEl ~2随着距离的增加没有显著减少，而且MUE3显著增加。基因intI1的下游归趋也是可变的，例如，基因intI1拷贝数在某些情况下非但没有减少，甚至增加了。

图1 通过qPCR对上游污水排放点附近和下游河水中的sul1和intI1水平(基因拷贝数/mL)进行定量。(a)苏士河和(b)穆尔格河中sul1和intI1基因的平均浓度。虚线是仅考虑稀释作用作为主要驱动力，根据公式，使用钠、carbamazepine(CBZ)和4/5-甲基苯并三唑(4/5 MeB T)作为保守示踪剂而得出的估计水平。浅红色的垂直线表示排污点。符号表示平均值，误差条分别为生物拷贝数的上限和下限。对于这里显示的所有样品，基因sul1和intI1的检测限都是12.5 拷贝数/mL。

为了进一步分析sul1和intI1基因是否存在偏离保守动态的断点，我们将稀释作为主要驱动因素，计算了整个研究距离内的抗性决定因素的预测水平。图1显示了基于三种不同的保守示踪剂对sul1和intI1的预测。在VIL中，除了VIL2中的intl1基因，测量水平总是低于预测水平。相比之下，MUE样品中存在几个测量值超过预测值的实例，在甚至大多数下游位点的intI1基因都是如此。MUE3在D5 ~ D8，sul1拷贝数显著增加，在5~6.8 km距离内，sul1基因拷贝数开始超过预测值。在MUE3，基因intI1拷贝数在下游5~6.8 km距离内也快速增加，这表明在河流的延伸中存在sul1和intI1基因拷贝数显著增加情况或存在非点源。我们将会在第10部分讨论可能存在的机制。

许多机制可以解释普遍观察到的拷贝数减少现象：沉降和捕食造成的细胞死亡，紫外线，或各种不利于废水细菌生存的环境条件。根据现有的数据，我们无法确定各种机制的作用。未来的研究可以在微宇宙或中宇宙实验中，或者在模拟自然水流的湍流系统中，探究耐药细菌或分子耐药标记的停留时间，以回答这些问题。利用颗粒大小、质量、流量特征等信息模拟废水源微粒的输送和沉积，可以提供关于沉积作用重要性的信息。

5 污水处理厂废水影响下游河流耐药基因组

为了更广泛地了解河流抗生素耐药基因组，我们从选定样品（VIL1、MUE 2和MUE 3）的宏基因组数据中检测ARG拷贝数。总的来说，鉴定出了65种ARG亚型，其中49种在上游和下游的河流样品中都有发现。离排污点最近的水中（D1）的抗生素耐药基因组明显受到排污的影响。例如，在D1中发现的36个ARG亚型中，有28个在污水中也检测到，而在US中没有发现其中16个ARG亚型。16个从污水中测出的耐药基因对以下抗生素类具有耐药性：1×氨基糖苷类抗生素、4×β -内酰胺类抗生素、1×氯霉素、2×大环内酯类、1×喹诺酮类、4×四环素；3个亚型为多药耐药基因。在这16个基因中，有14个在下游较远距离位置没有再检测到。这与qPCR 定量ARGs和intI1的结果一致，意味着大多数ARGs只存在污水中，在存在大量额外水流入以及拷贝数减少机制的河流中，长距离内不会以可检测水平一直存在。

6 河流中耐药基因组和微生物基因组的多样性

我们分析了河流中耐药基因组和微生物基因组的α和β多样性，我们想用另一种方式来观察污水处理厂排污的潜在影响，以及耐药基因组的动态是否与微生物群落有强烈的关联，正如废水处理过程中观察到的变化。与预期一样，污水中ARGs的香浓α多样性比US组高20.2~25.4%。因此，随着D1站点河水中ARG多样性的增加，我们观察到污水中耐药基因组的影响，特别是VILI和MUE3组。在所有样品中，下游的ARG α多样性下降。然而，对于以扩增子序列变异（ASVs）为代表的微生物群落，污水中的α多样性并不是始终高于US组，因此从US到D1位点α多样性也不是一直没有发生显著变化，下游也没有持续下降。这表明整个微生物群落的下游动态与抗生素耐药基因组不相关。

β多样性分析也得到了相似的结论。利用普氏分析方法分析微生物群落和抗生素耐药基因组之间的关系发现，仅在污水污染最严重的位点（D1）时，微生物群落和抗生素耐药基因组之间存在很强的结构相关性（P=0.002）。当排除D1样本时，相关性几乎不显著（P=0.04），这表明微生物群落与耐药基因组之间的结构相关性主要是由于污水处理厂排污的影响。在受影响较小的水域，结构相关性较弱，这表明缺乏有力的驱动因素，比如选择压力或外源ARB的涌入。

7 耐药基因组分析确认废水的影响和消除

为了更详细地定量研究河流中耐药基因组的动态，我们选择了7种最普遍的ARG亚型进行详细分析，它们至少在半数样本中出现。我们根据相对丰度计算了这组基因中每个基因的比例。相较于污水和D1，US组中6个基因（aph（3''）-I，aph（6）-I，mexT，tetQ，aadA，sul1）相比全部7个基因所占的比例更低。相反，基因bacA相比于污水、D1，在US、D5、D8中占了很大比例。因此，图2b中宏基因组组装的ARG的相对丰度和累积丰度图之外，以及图2c中它们的单个和累积环境水平。相对丰度和绝对丰度都表现出相似的模式——与US相比，在EF和D1中选出的ARG丰度更高。这6个基因的丰度随着下游位置而减少，除了MUE3采样中远下游位置（D8）的sul1（图6b）。该分析确定了废水对河流中普遍耐药基因丰度的定量影响，并指出在未来的研究中追踪人为耐药来源的其他候选基因（aph（3"）-I，aph（6）-I，mexT,tetQ，aadA和sul1），这些基因可能有助于追踪废水中的耐药性决定因素。其中一些基因已经被用作环境样本的耐药指标，与培养实验的方法结合运用，不需要培养实验的方法很少运用。

图2 河流中普遍和广泛的宏基因组装配ARGs的动态。(a) 7种最常见、最广泛的ARGs （aph（3''）-I，aph（6）-I，mexT，tetQ，aadA，sul1 and bacA）所占的比例。(b)和(c)是污水相关的6个ARGs的丰度堆积条形图(省略bacA)；(b)为相对丰度(GPM，gene per million)，(c)为绝对丰度(GPL，gene per liter)。EF样品用红色阴影表示，其他河水样品用蓝色阴影表示。

8 Contig分析表明ARG协同位点

（拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称为Contig，不含N（重叠群））我们假设一些ARGs的相似动态可能源于它们在同一宿主的相同位点或相同的遗传成分，所以我们分析它们contig序列的基因位点。我们确实发现在VILI的（EF, D1、D2和D5）许多样本中，基因aph（3''）-I和aph（6）-I位于同一contig序列中，这或许可以解释VIL1中aph（3''）-I和aph（6）-I之间强烈相似动态，R² = 0.98 （P< 0.001）。另一个ARGs相同位点的例子是sul1和aadA基因。在VIL1的D1中发现了含有这两个基因的contigs序列片段，在MUE3中的EF样品中也发现了这两个基因。然而，与VILI中的aph（3''）-I和aph（6）-I不同，基因sul1的动态与基因aadA不同，特别是MUE3中的D5和D8，基因sul1丰度较高，但没有aadA基因拷贝（图2b）。与这一观察结果一致的是，从MUE3中的D5和D8中检索到的含sul1基因却不包含aadA基因的contigs序列，这是在这些样品中识别出的唯一个（图3b）。这表明MUE3中D1和D3之间能产生含有sul1基因的contigs序列的细菌种群发生了显著的转移，而污水中含有sul1—aadA的contigs序列并不会一直存在。

图3 基因aph和sul1在contigs上的基因排列。(a)从所有样本中选出的含有aph（3''）-I和aph（6）-I基因的contigs，(VIL1, MUE2 &3）。(b)从MUE3中检索到的包含sul1的Contigs。利用DIAMOND蛋白搜索与NCBInr蛋白数据库比对，所有注释基因在蛋白质水平上与参考序列均显示出>90.0%的序列相似性(PIdent)。Contig ID是斜体的(例如k121_XXXXXX)。P_{tot_aph}表示包含aph基因的contig的平均覆盖度占样本中已识别的所有含有aph基因的contigs的平均覆盖度之和的比例。P_{tot_sul1}表示样本中已识别的所有含有sul1的contigs的平均覆盖度与所有含有sul1基因的 contigs的平均覆盖度之和的比例。

9 一种在环境细菌中普遍存在的抗生素耐药基因——bacA

与其他普遍存在的基因不同，bacA（也称为UppP，undecaprenyl- diphosphate or -pyrophosphatephosphatase）在US样本中所占比例最大，在许多下游样点也有大量的bacA基因拷贝（除了MUE3中的D5和D8，其中sul1基因占比例最大）（图2a）。为了进一步评估bacA基因是否存在于我们的河水样本中，我们通过结合多种方法对宏基因组组装的contigs进行分类，确定了潜在的宿主。我们获得了利用三种分类方法在属水平上一致相似的contigs序列。被鉴定为bacA contigs序列潜在宿主的4个属分别是Pseudomonas、Acidovorax、Limnohabitans和Aeromonas。其中，Pseudomonas、Acidovorax和Limnohabitans是淡水和土壤环境的典型物种。然而，考虑到从每千碱基读数来看，contigs中的bacA占样本总bacA基因的比例较低（MUE3中的D8除外），我们假定bacA基因的同源基因可能存在于许多其他环境细菌中。因此，我们的数据表明bacA基因可能不适合追踪抗生素耐药性的人为源头。

10 探究MUE3远距离下游区域sul1快速增加的原因

基于qPCR和宏基因组的分析都证实了sul1和intI1在MUE下游基因拷贝数的增加，特别是在一次采样（MUE3）下游5.0-6.8 km之间的距离。

为了弄清楚这种sul1和intI1的意外增加是否是因为生物驱动因素，我们首先对含sul1的contigs进行了表征。众所周知，基因sul1是普遍携带的，通常与intI1基因连锁。事实上，从河流中检索到所有含有intI1—sul1基因的contigs序列（D3~8）都是单一显性同源基因，它似乎也与质粒有关，因为它包含质粒相关基因parA。毫无疑问，我们无法从这些序列中得到有意义的分类。它因此不能证明MUE3下游的增加究竟是由于污水，还是环境中的有机体，或是当地的污染源。在未来的研究中，利用宏基因组分析可能获得更深入的信息。因此我们转向化学指标，以进一步研究是否是局部或非点源污染的原因。

为了评价非点源污染物输入，我们选择了一些可作为污染指标的微量污染物进行评价。磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine）用于养猪业/畜牧养殖业，甲丙基丙烯（mecoprop）是一种除草剂，主要用于瑞士的城市环境。假定如果存在明显的农业或城市地表径流，下游地区的这些污染物水平将增加或持续偏高，这可能与农业或城市地区存在的耐药基因和耐药细菌有关。在VIL中，除一个US样本外，所有样本中的磺胺二甲嘧啶均低于检测值（LOD为0.8 ng/L），而在MUE存在含磺胺二甲嘧啶的污水排放，特别是在MUE3采样期间，但在下游位置未观察到该化合物增加。丙酸（mecoprop）的浓度和下游动态在不同的采样中有所变化。对于VIL1~3、MUE1和MUE3，丙酸浓度较低（< 60 ng/L），而MUE2似乎有大量的废水输入，下游的浓度仍然很高（>200 ng/L）。在MUE3 1.0-2.0km之间以及MUE2下游大于5km范围丙酸含量略有增加可能是由于来自污水处理厂废水波动输入导致的。在较远的下游位置（D8）并未进一步增加，而sul1和intI1基因突然增加。基于这些，以及其他分析的微量污染物，我们没有发现存在下游污染源的明显证据。然而。这些化学指标并不是决定性的，因为所分析的化合物并不是用于追踪下游河段非点源的综合选择（例如，施用肥料或杀虫剂，尽管在干燥天气条件下不太可能）。因此，虽然我们没有发现这些污染的证据，但我们也不能排除它们导致MUE3中sul1和intI1基因明显增加的可能性。

最后，利用MUE3中下游位置抗生素和重金属浓度评估了原位抗性选择的潜力。磺胺甲恶唑及其衍生物（N4-acetylsulfamethoxazole）在所有已分析抗生素中浓度最高，但下游浓度仍远低于发表的可产生耐药性选择的预测无效应浓度（PNEC）。通常与磺胺甲恶唑一起开处方的甲氧苄氨嘧啶（trimethoprim）的浓度也远低于可产生耐药选择的PNEC。尽管本研究中分析的绝大多数金属低于其定量限度，或低于其估计的水中溶解金属最低协同选择浓度（MCCwater_DC），但两种金属（铜和镍）的浓度要高于其MCCwater_DC（Cu为1.5 μg/L, Ni为0.29 μg/L）。然而，MCCwater_DC是一个预测值，实际选择水平比同一次采样的其他位点可能会更高，而不同采样时间相同位点的sul1和intI1基因增加不明显。此外，在MUE中我们基于contigs的协同定位搜索，也未能发现sul1基因与任何其他可能与Cu、Ni或任何其他金属抗性相关的基因的协同定位。总体而言，没有可信的证据表明Cu和Ni的原位抗性协同选择导致下游sul1和intI1基因的增加。我们进一步注意到，估算的河流滞留时间相对较短，这使得水体中原位耐药性选择的可能性更低。

作为最后的可能解释，我们考虑了细胞从其他河流迁移的可能性。根据表层沉积物中ARGs和intI1基因的qPCR计数，我们没有在MUE3中的D5和D8中观察到sul1和intI1基因在绝对丰度和相对丰度水平的增加。此外，沉积物中sul1和intI1基因的相对丰度与MUEl~3基本相似，甚至低于MUEl~3的相对丰度。如果沉积物再悬浮是MUE3 的D8水体中sul1和intI1基因升高的主要原因，则sul1和intI1基因在水样中的相对丰度将保持不变或下降。虽然我们不能完全排除沉积物再悬浮的可能性，但我们假设，sul1和intI1基因在绝对丰度和相对丰度方面可能有其他来源（如流动生物膜）选择性富集。考虑到在MUE中，由于高的污水投入和下游较低的稀释效应，特别是在第三次采样时，耐药性决定因素和营养物质的下游含量都相对较高，系统内生长是一个合理的假设。

在MUE3采样时sul1和intI1基因显著增加的原因和本质依然未解决，因此需要进一步研究。我们的观察清楚地表明，ARGs的增加可能是出乎意料的，也可能不是直接由人为污染引起的。特别是sul1和intI1基因通常用于追踪环境中ARG人为输入源，我们建议监测策略应采用多靶点策略，以保证稳定可靠。

下游的抗生素耐药决定因素含量在2.0-2.5 km内迅速下降是由于稀释效应造成的，较远距离的衰减是由于存在其他拷贝数减少机制。这表明公众可能仅在离排污点很近（几公里）时才会受到污水来源的抗生素耐药性的严重危害，特别是存在明显的径流输入。

我们在这条河中至少观察到一个sul1和intI1基因动态增加的例子，但没有发现这与当地人为污染的任何关联。其他可能发生生物量的系统内生长的河道隔室可作为未来研究的监测目标。

基于宏基因组学的耐药基因组分析与选择目标的qPCR分析得出的结论一致，本研究提出了未来监测抗生素抗性人为源头的候选基因。在普遍的宏基因组学研究中，基于qPCR和培养实验得出了一致的动态。公共卫生建议可以基于量化的指标基因或技术上更简单的基于培养实验的指标。

耐药基因组和微生物组之间的微弱的结构相关性，以及低水平的（co）选择因子揭示了在受干扰较少的河流水域（下游超过3公里的距离，加上上游位置）缺乏驱动因素。

我们发现基于contigs的分类方法和组装ARG的遗传邻域分析可以揭示有关ARG宿主转移、可动化、ARG协同位点的重要信息，否则这些信息将被埋没。

抗生素是二十世纪人类最伟大的发现之一，而抗生素的滥用却给世界带来了巨大的隐患。本文结合物理化学方法、耐药细菌培养实验、qPCR技术、16s rRNA扩增子测序技术、宏基因组测序技术综合分析了河流中抗生素耐药基因组的归趋。本文有助于系统地、跨学科地了解受污染严重的河流中驱动抗生素耐药基因组归趋的重要机制，作者的思路非常清晰，考虑非常全面，探究过程环环相扣，讨论部分层层递进，对将来的相关研究有很好地指导、借鉴意义。