编译：Rivc，编辑：木木夕、江舜尧。

原创微文，欢迎转发转载。

采样地点位于ETNP OMZ（世界三大OMZ之一）内。于2018年3月和4月在R / V Sally Ride上的三个站点（图1a）进行了采样。这三个采样点代表了从近海到陆上的样带，从低生产力到高生产力的梯度，以及从OMZ的海洋边缘到沿海站的密集ODZ。收集不同深度的海水，同时记录两种Seabird的温度，压力，盐度，叶绿素和原位O₂浓度和STOX 传感器。溢流3次后，从Niskin瓶中收集用于测量原位N₂O浓度的样品，放入160 mL瓶中，并用饱和HgCl₂保存。N₂O浓度是在同位素比质谱仪上根据主要离子（m / z = 44）峰面积测量的。通过Sterivex过滤器（0.22μm）从Niskin瓶中滤出多达4 L的海水，收集用于微生物DNA和RNA分析的颗粒材料。在每个样点的10个深度处测量N₂O消耗率。动力学模型和原位速率估计通过将N₂O消耗速率和N₂O浓度数据拟合到Michaelis-Menten方程。进行DNA和RNA提取，定量PCR (qPCR)分析，以及利用nosZ基因芯片检测样品之间的显着差异并确定OMZ nosZ基因的系统亲和力。

图1 ETNP OMZ的PS1，PS2和PS3的采样站位置以及O₂，N₂O，N₂O消耗率和nosZ拷贝数

1. OMZ中的N₂O消耗率和消耗N₂O的微生物

在ETNP OMZ的三个样点确定了潜在的N₂O消耗率（以下称“测得率”）（2018年3月）（图1a）。在标准站PS1（在OMZ的西边缘），PS2（公海站）和PS3（沿海站）对标准液中添加的最终浓度为50 nM的（¹⁵N）O₂示踪剂进行了改良，以改善缺氧条件。在不同深度下，测得的N₂O消耗速率从零到5.1 nM d-1不等（图1c， f）。缺氧水中的测得速率与先前在ETNP中测得的速率相同数量级，但低于该研究中一个沿海站点的速率，表明N₂O循环的高变异性。值得注意的是，大量的N₂O消耗率在无氧培养中也进行了测量，甚至在含氧表面海洋收集的样品中也是如此，其中存在消耗N₂O的微生物并转录了nosZ基因（图1d，g，j）。在从60 m采集的样本中检测到PS2站点的最大速率，其中原位O₂为173.9μM。在去除氧气的地表水中测得的N₂O消耗速率与ODZ中测得的速率相似或更大。在与ODZ层相同N₂O和O₂浓度下，有氧层中的消耗率较高，这可能是由于与较深的ODZ层相比，在较浅的深度处有更多的可用溶解有机物或存在不同的微生物群落。含氧地表水中消耗N₂O的微生物至少与ODZ中的一样丰富（图1d，g，j）。在ETNP的3个样点，ODNP的1个样点中，在ODZ上方的含氧水中检测到各种N₂O微生物。在ETNP中，RNA水平上的nosZ微生物的群落组成，有氧水和ODZ水之间存在差异（图2b）。检测到ETNP OMZ的氧化层和含氧表面海水中的样品中N₂O消耗以及所有三个主要OMZ中都存在消耗N₂O的微生物（图2a），这表明ODZs上方的氧化层中的微生物具有至少在缺氧条件下消耗N₂O的能力。

图2 nosZ DNA和nosZ RNA转录趋势对应分析（DCA）

2. 消耗N₂O的微生物对O₂的耐受性

确定消耗N₂O的微生物的O₂耐受性，通过在一定范围的O₂条件下孵育海水并使用光学O₂传感器测量与每种速率对应的O₂浓度。当O₂最低时，N₂O消耗率最高（图3）。在含氧海水样本中进行缺氧培养时，测得的比率最高（图3b，c和表S3），这些速率远高于从同一站的缺氧深度采集的样品中测得的速率（图3d–g）。这些结果表明，当条件变为缺氧时，在有氧层中发现的消耗N₂O的微生物比厌氧生物具有更快地代谢N₂O的潜力（图1d，g，j）。在PS1和PS3，较高的N₂O消耗潜力也对应于在有氧层中较高的nosZ基因拷贝数（图1d，j）。 N₂O消耗随着含氧量的增加，含氧海水样品中的比率急剧下降，这表明含氧海水中消耗N₂O的微生物（图3a–c）比含氧海水中的微生物对氧的敏感性更高（图3d–g）。尽管在高氧气浓度下氧化层样品中的N₂O消耗并未发生，但是从有氧原位条件转变为无氧培养条件后迅速开始（≤1天）。响应速度之快可能是由于消耗N₂O的微生物的生长，快速酶（N₂OR）的翻译，或者是在采样之前在含氧海水中已经翻译过的N₂OR的响应。结果表明N₂OR在有氧条件下没有活性，但此处（图1d，g，j）获得的分子数据表明，nosZ RNA和N₂OR都可以在有氧条件下合成。这种现象也出现在其他环境中，不管快速反应的机理如何，结果表明，含氧海水中的微生物具有消耗N₂O的遗传潜力，其消耗不受有机物供应的限制（原位受有机物限制会阻止观测到的速率增加）。增加N₂O浓度（图4a–c），并且它们可以在缺氧条件下消耗N₂O。这些缺氧条件可能在其他含氧水中小规模发生。

图3 ETNP OMZ三个站N₂O消耗的O₂耐受性

3. 消耗N₂O的微生物的底物亲和力

在没有O₂的培养中，N₂O消耗的实测Km值（Michaelis–Menten曲线的半饱和常数）（图4）在每个站和深度处都超过原位N₂O浓度（图1b，e，h），表明原位N₂O浓度太低而无法饱和N₂O消耗率。值得注意的是，在去除氧气后，氧化层中潜在的最大N₂O消耗速率远高于同一站点的ODZ中的最大消耗速率（图4），并且在有氧和无氧条件下，消耗N₂O的微生物的底物亲和力是明显的深度（图4）。一致地，ETNP的有氧层和无氧ODZ之间在RNA水平上消耗N₂O的微生物的群落组成也有所不同（图2b）。这些结果表明，应将不同的动力学参数应用于缺氧N₂O汇和含氧层中新发现的潜在N₂O汇的估算。底物亲和力的差异很可能是由于占据不同生态位的各种消耗N₂O的微生物所致。可以确定PS2站的有氧层和PS3站的有氧-缺氧界面的N₂O消耗的重要Km（图4b，e）。缺氧ODZ样品中缺乏Michaelis-Menten动力学（图4f，g），这表明除添加的底物外其他因素（例如有机物）限制了N₂O的消耗。 PS3站有氧层的Km可能大于PS2站的有氧层，因为该速率甚至在最大N₂O浓度下也不会饱和（图4c）。至于PS1站，第4个数据点的下降速率表明，具有不同基质亲和力的消耗N₂O的微生物混合存在（图4a）。尽管不重要，但仅包括前四个数据点时，Km为110（±230）nM。当排除第四个数据点时，站PS1的有氧层的Km为1354（±653）nM。氧化层样品中的Km值越大，表明那里的微生物对N₂O的亲和力越低。在本研究确定的Km值范围内（有氧层中为2.8μM，ODZ顶部为0.3μM，图4）具有不同的群落组成，但最丰富的原型的相似性相似，意味着ETNP中有氧和ODZ组合之间的群落组成不同（图2b），以及ETSP和其他两个OMZ之间的差异（图2a）是由低丰度微生物的多样性而不是少数丰富的进化枝导致的。

除缺氧培养外，还研究了缺氧培养中的N₂O消耗动力学。与消耗N₂O的微生物的低O₂耐受性相一致（图3），在大多数添加O₂的培养中无法确定N₂O消耗的动力学，因为未检测到N₂O消耗率（图4）。只有PS3站有氧-缺氧界面的样品在有氧培养中显示了Michaelis-Menten动力学（图4e），这可能是因为在该有氧培养中添加的氧气（4.5μM，表S3）少于所有其他有氧培养和消耗N₂O的微生物比增加有氧层的微生物具有更高的耐受O₂浓度的能力（图3e）。这里允许发生N₂O消耗的O₂浓度（≥4.5μM）远远高于先前确定的反硝化阈值（0.2–0.3μM）。这是由于拥有反硝化途径不同部分的微生物对O₂的敏感性不同。在从NO₂产生N₂O的O₂阈值中也观察到了不同的氧气敏感性，后者对O₂的耐受性更高。另外，与在有氧层中存在nosZ不同，在有氧层中以亚硝酸盐还原酶基因（nirK和nirS）非常少。这些观察结果表明，反硝化作用可以通过具有该途径不同部分的独立生物体以模块化的方式进行，而不是一种无需交换中间体即可发生的耦合反应过程。

图4 ETNP OMZ三个站N₂O消耗速率的N₂O动力学

4. 估算的N₂O消耗和生产率

由于速率对底物浓度和其他环境因素（例如O₂浓度）的依赖性，在温育实验中推断出的生物地球化学过程的速率可能会偏离原位值，而这些因素通常在原位和培养条件之间会有所不同。但是，使用动力学参数，基于微生物对氧气的高度敏感性（图3a–c），可以推断出在氧气层中大多数原位N₂O消耗速率为零（图1c，f，i）。在PS2站的90m处是一个例外，该处的原位O₂浓度（4.4μM，表S1）可能足够低，以基于缺氧孵育和在PS3与4.5μM O₂孵育的相似动力学，可以消耗N₂O（图4e）。使用此处确定的Km值（图4e）和原位，通过Michaelis–Menten方程模拟缺氧ODZ中的N₂O消耗速率。 N₂O浓度（图1b，e，h）。在所有三个站点上，测得的N₂O消耗速率在上氧化层的最大值都高于N₂O浓度峰值，但这些站点的估计原位速率的最大值出现在有氧-缺氧界面或以下，PS2站点的速率最高（6.3 nM d-1）位于ODZ的下边缘850m（图1c，f，i）。使用原位N₂O浓度进行校正后，由于原位N₂O浓度较低，因此PS2站ODZ内部N₂O消耗的次要峰值大大降低了（图1e）。但是，校正后，PS1站ODZ内部的峰较大，这是因为原位N₂O浓度高于孵育中的浓度（50 nM）。 PS1站的ODZ核心中N₂O浓度持续升高，反映了在OMZ边缘通过反硝化去除N₂O的速度较慢。 PS1站缺少缺氧ODZs的典型特征SNM也与其在位置1的位置一致。 OMZ的海洋边缘。实测速率与动力学校正后的原位速率之间的差异表明，需要更多有关不同环境条件和不同OMZ区域中N₂O消耗动力学的信息。N₂O生产率是根据估算的。使用一维稳态框架（图5）进行原位N₂O消耗速率，N₂O浓度，对流和扩散（图5），这反映了较弱的横向对流和上升流的情况。生产和消费率基本平衡，但在PS3站以急剧的N₂O浓度梯度解耦。生产和消耗的解耦是由于物理过程（即对流和扩散）中强烈的N₂O通量，而N₂O的陡峭梯度与O₂的陡峭梯度相吻合。以前没有报道过这种解耦，因为N₂O消耗的测量值都在上氧化土的底部以下。值得注意的是，含氧量的模拟生产率考虑到平流，扩散和估计的零消耗率（表S1），原位O₂为199.0和89.9μM的站PS1和PS3的水层（图5）为负。由于生产率不能为负，因此该分析表明，至少有时在这些深度处会发生N₂O消耗，以平衡来自物理过程的N₂O通量。与模型结果一致，检测氧气时的N₂O消耗率大于4.5μM阈值，尤其是在PS3（图3c，e，j）。在有氧条件下的高比率可能意味着在沿海站有更多的微缺氧场所（例如，颗粒有机物）。尽管我们在这里选择4.5μM作为保守的氧气阈值，但在未来的研究中需要针对不同的环境条件确定不同的N₂O消耗阈值。

图5 ETNP OMZ站PS1，PS2和PS3处的模拟N2O生产率的深度分布图以及观察到的O₂（μM，灰色线），N₂O（nM，黑色虚线）N₂O消耗率（蓝色圆圈）

5. 对海洋N₂O估算的意义

 根据最近的估计，海洋每年的N₂O排放率为3–5Tg-N yr^-1。了解如何控制N₂O的主要生物汇是至关重要的，这对于更好地限制高度不确定。使用直接速率测量，证明了N₂O生产热点上方有氧层中的微生物集合体在缺氧条件下消耗N₂O的能力，并量化了速率对N₂O和O₂浓度的依赖性。在有利条件下（即低O₂和高N₂O浓度），含氧海水中潜在的N₂O消耗速率比ODZ至少两个数量级。即使当表层海水被O₂饱和时N₂O不太可能被消耗，但N₂O的消耗在切换到缺氧条件后迅速开始。在O₂浓度低而N₂O浓度高的氧跃层中也发生N₂O消耗。高N₂O浓度氧化中的氮源归因于反硝化和硝化作用的产生，以身份鉴定为主要来源。假设缺氧在ODZ上方的层中短暂发生，则消耗率根据使用原位N₂O浓度（表S1）测得的速率估算出，其消耗量与测量N₂O的N₂O产生速率相同。缺氧条件可能发生在有氧层中的微场所。与ETNPOMZ中的自由活动部分相比，发现nosZ转录本在颗粒相关部分中高度富集。此外，涡流，上升流和其他动态混合事件可能会导致低氧，高N₂O海水和消耗N₂O的微生物泛滥。根据Argo浮游数据和电导率-温度-深度（CTD）数据，在ETNPODZ上方的氧跃层中的O₂浓度在几天或几周内从近100μM变化到低于检测值。因此，当发生表面缺氧时，表面层中的微生物或进入表面层的地下微生物可能会消耗一部分N₂O，然后逸出到大气中。在所有三个OMZ的上部氧化层中检测到可行的消耗N₂O的微生物意味着非常规的含nosZ的微生物在调节N₂O预算方面具有潜在的作用。这些微生物在所有三个OMZ中的存在及其潜在的N₂O吸收剂，提高了在其他两个OMZ中量化这种潜力的必要性。在这项研究中获得的底物动力学和生物学信息为表征海洋N₂O模型中的N₂O消耗提供了以前缺乏的参数。将此处获得的用于N₂O消耗的新O₂阈值（4.5μM）应用于机械的一维生物地球化学模型会产生N₂O峰和O₂剖面，类似于我们在开放海洋站通过反硝化生产N₂O的O₂阈值得到的测量结果也增加了（至20μM）。海洋氧化还原梯度的N₂O产生和消耗的O₂阈值需要进一步研究，但是在修改后的模型中，反硝化产生的N₂O产生的高O₂耐受性与先前的实验结果一致。需要进一步的动力学和分子实验来研究同一样品中具有不同底物动力学的微生物的共生（图4a）以及微生物群落的N₂O消耗和产生的空间变化。OMZ不仅是最强烈的N₂O循环区域，但也会导致全球N₂O排放量出现较大的季节性变化。因此，这里的发现不仅将改善对这些N₂O汇的估算，还将改善对N₂O来源的估算，这是限制在不断变化的海洋中的两个关键变量。

本研究确定了含氧和缺氧海水中的动力学参数，发现了含氧水中消耗N₂O的微生物的底物亲和力，O₂耐受性和群落组成与缺氧层中的微生物不同。并估算原位N₂O消耗和生产速率。为改善对N₂O汇的估算，及对N₂O来源的估算具有重要意义。

你可能还喜欢

1. 2020年度回顾 | 技术贴合辑
   

2. 2020年度回顾 | 微生态人体微生物类微文大合辑
   

3. 2020年微生态最值得看的环境类微文回顾

微生态科研学术群期待与您交流更多微生态科研问题

（联系微生态老师即可申请入群）。

了解更多菌群知识，请关注“微生态”。

阅读原文

微信扫一扫
关注该公众号