海洋冷泉通常出现在大陆架边缘，主要以深部地质来源的气态和液态烃类为特征。冷泉渗漏流体可以通过生物过程（浅层沉积物中的产甲烷作用）产生，也可以从埋藏较深的地层中长期存在的热成因油气系统中获得。在全球气候变化的背景下，从深海冷泉沉积物中逸出的甲烷和其他短链烷烃会进入大气，加剧温室效应。因此，了解与冷泉有关的海洋沉积物中的生物地球化学循环对于应对能源和气候挑战非常重要。

冷泉是一种化能合成生态系统，含有丰富多样的古菌和细菌，在烃类代谢中起着重要作用。这些微生物种群不仅对沉积物-水界面的冷泉生物地球化学过程具有显著的影响作用，而且对海底硫酸盐还原、硫氧化、反硝化、金属还原和产甲烷等多种生物过程也有贡献。目前在冷泉沉积物中也观察到病毒，对墨西哥湾沉积物的荧光显微镜观察显示，冷泉沉积物的病毒颗粒计数以及病毒与原核生物的比率明显高于周围沉积物，表明冷泉生境可能是病毒的热点地区。这与由海底供应的富含能量的基质所驱动的高微生物活性相一致。此外，在甲烷渗出沉积物中也发现了新的病毒，包括Enterobacteria噬菌体的一个新的Microvirus属分支和一个与厌氧甲烷氧化古菌相关的潜在病毒。这些发现表明，冷泉中含有大量未被发现的病毒，这些病毒可能影响其微生物宿主，从而影响冷泉的生物地球化学循环。

由于难以采集和提取沉积物中的病毒颗粒，我们对病毒在深海沉积物中的生态作用的认识受到限制。近年来，测序和生物信息学的发展让我们可以在未分离病毒颗粒的情况下，从宏基因组测序数据中回收病毒序列进行分析。这些方法极大地促进了病毒生态学从新病毒鉴定到病毒全球分布的研究发展。来自各种环境的调查研究，如融化的永久冻土、红树林、北极湖泊、淡水湖、深海沉积物、陆地地下层、海水，表明原核微生物病毒通过与微生物宿主的一系列相互作用，在自然生态系统中起着关键作用。病毒可以通过裂解细胞和感染过程中释放细胞内容物来自上而下地控制微生物丰度，从而影响有机碳和养分的周转。它们还可以通过水平基因转移或在感染期间表达基因组中的辅助代谢基因（AMG）来促进宿主代谢。在瑞典冻土融化梯度的泥炭地土壤中，发现病毒编码的糖苷水解酶在复杂的碳降解中起着重要作用。在富含沉积物衍生甲烷的淡水湖泊中，发现某些病毒编码颗粒型甲烷单加氧酶的亚基，这表明它们可能在感染期间对细菌的好氧甲烷氧化过程起增强作用。许多研究还揭示了病毒在深海沉积物中的存在和丰度，因此以厌氧甲烷氧化为主的深海冷泉沉积物，为研究病毒及其与宿主的相互作用提供了一个契机。目前有很多冷泉沉积物来源的宏基因组测序，其中提取的DNA中包含了沉积物中病毒的基因组，但大多数研究只集中在细菌和古菌的基因组上，而忽略了病毒。

本研究，我们试图拓展病毒多样性和病毒在深海冷泉区沉积物中生态作用的理解。为此，对来自全球7个冷泉的28个海洋沉积物宏基因组进行了分析，以获得冷泉沉积物中病毒的基因组。对这些病毒群落的特征进行分析，有助于宿主的预测和AMG的鉴定。我们的发现揭示了冷泉病毒的全球多样性和生物地理特征，以及它们在底栖微生物生态和生物地球化学中的作用。

为了研究栖息在冷泉沉积物中的病毒的多样性和生态功能，我们从公共数据库中收集了0.38 Tbp的宏基因组学数据，并进行了分析，其中包括全球分布的七个不同类型的海底冷泉获得的28个沉积物宏基因组数据，涵盖了天然气水合物型，石油型和天然气渗漏型，泥火山型和沥青火山型（图1）。

图1 宏基因组数据采集地点的地理分布

冷泉沉积物细菌和古菌群落概述

为了评估这些沉积物中的整体微生物群落结构，从宏基因组数据中提取16S miTags用于分类学分析。对16S miTags在门水平（Proteobacteria在纲水平）的分类显示，主要的细菌类群为Chloroflexi（23％）、Atribacteria（23％）、Gammaproteobacteria（9％）、Deltaproteobacteria（9％）和Planctomycetes（6％）。在浅层沉积物中（海床以下< 0.2米），Gammaproteobacteria和Deltaproteobacteria的相对丰度较高，而Atribacteria和Chloroflexi主要存在于深层沉积物中。对于古菌类群，来自Methanomicrobia（Euryarchaeota）的成员平均占30％的古菌miTags，其次是Bathyarchaeota（TACK）占18％，Lokiarchaeota（Asgard）占16％。

通过宏基因组拼接和分箱共获得592个高质量或中等质量的微生物MAG（宏基因组组装的基因组），按照95％的ANI聚类，来代表物种水平。这460个细菌和132个古菌MAG分布在46个已知的门和4个未分类的门。在细菌域中，Chloroflexi（n=119）、Deltaproteobacteria（n=67）和Planctomycetes（n=44）的成员为优势类群。在古菌域中，MAG主要隶属于Methanomicrobia（n=41）、Bathyarchaeota（n=21）和Lokiarchaeota（n=18）。根据样品中MAG的相对丰度，同一区域或同一深度的样品在门水平（Proteobacteria和Euryarchaeota为纲水平）上的MAG相对丰度更相似，且分布模式与冷泉类型相关。所有七个地区均有的MAG包括Deltaproteobacteria（n=67），Planctomycetes（n=44），WOR-3（n=15），Bacteroidetes（n=14），Heimdallarchaeota（n=12）和Atribacteria（n=11）。

来自冷泉沉积物的病毒种类繁多且新颖

从28个宏基因组中，获得了39154个推测的病毒序列，进行人工筛选后以95％的ANI聚类，以代表近似物种水平的分类。这产生了2885个非冗余的冷泉vOTU，每一个都由contigs ≥10kb表示，其中包括四个≥200kb的contigs，可能属于巨病毒。使用CheckV估计了宏基因组组装的病毒基因组或基因组片段的完整性，产生了四个不同的质量等级：完整基因组（vOTU的10％），高质量（4％），中等质量（11％）和低质量（58％），其余未确定。

尽管一些冷泉vOTU在多个沉积物样品中数量都非常丰富，但绝大多数（84％）的vOTU仅存在于单个冷泉位点中。进一步分析七个冷泉位点的病毒分布还显示，冷泉病毒分布显示出高度的特异性，类似于先前在甲烷渗漏区原核生物中发现的情况。在这七个位点之间，病毒Shannon多样性，Simpson多样性和Chao1丰富度均显著不同。根据流体流态，将七个冷泉划分为矿物或泥质型系统。NMDS分析显示，两个系统之间的病毒群落明显不同（图2）。其他因素也有助于病毒群落结构的形成，可能包括沉积物深度。总体而言，这些结果表明，流体通量是造成冷泉沉积物中病毒多样性差异的重要原因之一。

图2 不同类型冷泉病毒群落多样性的比较

为了研究冷泉病毒与来自更广泛多样性生态系统的病毒之间的关系，利用vConTACT2构建了一个基因共享网络。冷泉沉积物，海水，湿地和多年冻土的vOTU被划分为3082个病毒簇（VC）（图3）。其中只有17个VC是在所有生态系统中共享的。从各种生态系统采样的病毒基因组之间聚集的程度有限，可能反映了高度的病毒生境特异性。很少有冷泉病毒（~0.7%）与来自RefSeq数据库的病毒聚集在一起，并且与最近使用类似方法估计的土壤病毒相比，该比例要低得多。这些分析表明，冷泉沉积物蕴藏着大量未知的病毒多样性。此外，使用快速基因组聚类，仅发现62个vOTU与IMG/VR v3数据库中的病毒聚类。

图3 冷泉病毒的分类多样性

病毒与宿主的联系以及与宿主相关的病毒丰度和病毒生活方式

通过比较序列相似性、寡核苷酸频率、tRNA序列和CRISPR间隔区， 2885个冷泉vOTU的14.2%可被预测到潜在宿主。与以前的观察结果一致，这些vOTU中的大多数被预测具有狭窄的宿主范围，只有54个vOTU可能在多个门上表现出更广的宿主范围。每个病毒种群保留一个预测的宿主。预测的原核宿主跨越9个古菌和23个细菌门，其中Thorarchaeota（占病毒宿主对的19％）和Chloroflexi（占14％）（图4）是最经常被预测的宿主。相当一部分（40%）的冷泉病毒与古菌有关，包括Bathyarchaeota、Asgard群、Methanomicrobia、Thaumarchaeota和Thermoplasmata的成员。以前在自然生态系统中还没有关于古菌病毒如此广泛宿主范围的报道。与IMG/VR v3数据库相比，还发现了几种新的病毒-细菌联系，包括Bipolaricaulota，Coatesbacteria和Sumerlaeota的病毒。

图4 冷泉病毒与宿主的关系

基于MAG中存在的功能标记基因，预测的宿主包括两个好氧甲烷氧化细菌、13个厌氧甲烷氧化古菌（例如ANME-1和ANME-2）、一个多碳烷烃氧化菌，16个硫酸还原菌（主要属于Deltaproteobacteria）以及许多呼吸和发酵异养菌。总的来说，我们发现了22个vOTU，它们可能感染能够基于甲基/烷基辅酶M还原酶进行厌氧气态烷烃氧化的古菌。硫酸盐还原菌Desulfobacterales8_GM_sbin_oily_21的基因组还包含可能编码长链烷烃和芳烃的厌氧降解相关的烷基/芳基烷基琥珀酸酯合酶的基因。这些结果表明，介导烃类和硫循环的种群可能容易受到冷泉中病毒种群的裂解。在冷泉中，硫酸盐还原与甲烷和其他渗漏烃的厌氧氧化相耦合。在候选门辐射类群CPR（6个vOTU被预测感染Patescibacteria）和DPANN古菌（13个vOTU被预测可感染Pacearchaeota或Aenigmarchaeota）中也鉴定到了预测宿主。

根据丰度预测，目标宿主在冷泉病毒群落中的比例大于20%（图5）。当在门水平上分组时（Proteobacteria和Euryarchaeota在纲水平），预测的微生物宿主的相对丰度组成与其对应病毒的组成模式一致。宿主和对应病毒丰度的回归模型也支持了这一点。大多数病毒与其宿主相比具有更高的基因组覆盖率，这表明大多数分类群可能正在进行活跃的病毒复制，并可能在样本收集时就已经将宿主裂解。大多数分类群的类群特异性病毒与宿主丰度比（即VHR值）大于1，其中Thorarchaeota最高，为102.5，表明病毒基因组复制活跃水平较高。这与使用荧光显微镜在墨西哥湾冷泉沉积物中检测到病毒颗粒丰度高于非冷泉沉积的结果一致。因此，病毒裂解可能是一个主要的自上而下的因素，导致冷泉沉积物中微生物的死亡率很高。此外，基于其包含整合酶基因和/或位于其宿主基因组内的contigs，预测至少372个冷泉vOTU具有溶源性（即温和病毒）。

图5 冷泉中病毒及其预测宿主的相对丰度模式

参与碳、硫和氮转化的病毒AMG

为了进一步了解病毒如何影响冷泉沉积物的生物地球化学循环，我们检测了病毒感染期间辅助宿主代谢基因AMG。总体而言，基于VIBRANT注释，冷泉病毒倾向于编码用于辅助因子/维生素以及碳水化合物代谢的AMG。相当一部分还编码氨基酸和糖代谢的AMG。基于DRAM-v注释和人工检视，我们从29个vOTU中识别了32个AMG基因，这些vOTU编码与复杂碳水化合物的初步分解有关的碳水化合物活性酶。其中6个基因与糖苷水解酶有关，根据蛋白质三维结构模型预测，糖苷水解酶可催化复杂糖的水解（图6），包括GH10、GH136、GH33和GH74。此外，还发现了与ABC转运蛋白有关的AMG，它们涉及碳水化合物、中心碳（例如UDP-葡萄糖4-表异构酶）和C1代谢（例如转酮醇酶）。据报道，冷泉沉积物微生物参与了多种碳水化合物降解反应，以处理上覆水柱供应的碎屑有机物。通常，包含与碳水化合物降解有关的基因的病毒与其在感染周期对宿主代谢的支持作用相一致。

根据VIRBANT注释，与硫代谢有关的最常见AMG是磷酸腺苷磷酸硫酸还原酶（PAPS还原酶或CysH），预计可参与同化硫酸盐还原。还从缺氧水柱，瘤胃，深层淡水湖和硫化矿尾矿获得的基因组序列中发现了编码CysH的病毒。在这里，我们手动确认了来自两个不同病毒属的三个vOTU编码了PAPS还原酶基因。三个具有代表性的PAPS还原酶基因包含PAPS还原酶的保守结构域和结构配置，其同化硫酸盐以生物合成蛋氨酸和半胱氨酸。这三种病毒中的一种可能感染ANME-1。此外，还鉴定了与氨基酸相关的ABC转运蛋白，突显了这些群落中有机氮代谢的另一种潜在途径。

图6 病毒编码的辅助代谢基因的上下游基因排布和蛋白质结构

由于深海沉积物采样以及微生物群落及其病毒的实验室培养面临困难，病毒在冷泉沉积物中如何影响微生物死亡率、生态和进化的科学问题仍然没有得到很好的解答。在这项研究中，对非靶向宏基因组数据的深入探索成功地揭示了新颖、丰富和多样的细菌和古菌病毒。预测的许多冷泉微生物宿主大多属于未培养的类群。这些结果扩展了古菌病毒的多样性，尤其是那些感染烃类渗漏区微生物群中重要古菌类群的病毒，例如Euryarchaeota，Bathyarchaeota和Asgard组的成员。尽管很大一部分病毒似乎是溶源性的，但许多病毒基因组的丰度计算表明，病毒裂解是冷泉沉积物中微生物死亡率和生物量更新的主要推动力。病毒编码的AMG（包括与碳、硫和氮代谢相关的基因）可能在感染期间增强原核宿主的代谢，从而可能改变由冷泉微生物介导的生物地球化学过程。作为原核生物多样性的地下储集层和微生物活性的热点区，冷泉也是病毒活跃的绿洲。关于病毒对冷泉和其他海洋环境的作用贡献还有很多有待揭示，尤其是病毒在水平基因转移中的潜在作用，这项研究未对此进行探讨。由于本研究中只有一小部分vOTU能够被分类，而且许多vOTU预计会感染特征不明确的分类群，因此在对这些环境的微生物学的理解上仍然存在很大的差距。

本文译者

中山大学海洋科学学院本科生：卢梓健

本期审校：董西洋  卢瑟菌

本期排版：卢瑟菌

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