编译：24桥明月夜，编辑：木木夕、江舜尧。

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本试验以Mimosa scabrella为接种对象，进行丛枝菌根真菌（AMF）、结瘤相关菌（nodule-associated bacteria）及固氮菌（N₂ fixing bacteria）的单独以及配伍接种，我们用无菌土壤接种AMF、固氮和结瘤相关细菌的所有组合，在生长室中培育幼苗90天。研究了不同接种方式对Mimosa scabrella生长，根系性状，结瘤和固氮的影响。

图文摘要

1 寄主生物量响应

未接种的对照相比，接种Rhizophagus intraradices和固氮菌 Paraburkholderia sp.的Mimosascabrell的根生物量显著(p ≤0.001)增加了45.8%和70.2%(图1)。此外，与对照相比，这些共生体的共接种使地上部干生物量增加了3.7倍。这包括相对于对照的单独接种的总和大71%的协同效应(图1)。根干重的响应幅度较小并与茎干生物量的响应幅度相似。接种结瘤相关细菌Paraburkholderiasp.对植物生物量没有显著影响(p=0.98) (图1)。

图1 接种丛枝菌根真菌（M）、非结瘤与结瘤相关菌Paraburkholderiasp.（E）和固氮菌Paraburkholderia sp.（R）对Mimosa scabrella地上部和地下部干重的影响。

2 根系性状的响应 

根系性状包括根长、表面积、单位体积长度、土壤中占用空间、分枝数、根尖数等根系性状之间(p<0.001)及地上部生物量(R²>0.6)呈极显著正相关。固氮菌Paraburkholderia sp.对根系性状有显著的正效应。无论是单独接种，还是与任何其他微生物共生体联合使用，都会对所有的根系性状产生影响。与单独接种AMF相比，在固氮菌Paraburkholderia sp.和Rhizophagus intradices的联合接种的情况下，所有性状的根系反应都更强。例如，与对照或单独接种菌根相比，共生菌组合的根长度、表根面积和根体积增加了近3倍。相反，接种结瘤相关的细菌Paraburkholderia sp.的不同处理之间的根系性状没有显著影响(。

比根长(SRL)受Rhizophagus intraradices和不同类型的Paraburkholderia sp.的交互作用影响显著(p=0.03)。与单独接种处理相比，这种交互作用导致SRL降低了约30%(图2A)。此外，AMF的根部定殖率与SRL呈显著负相关(r²=0.61；p<0.001；图2B)。

图2 接种丛枝菌根真菌（M）、非结瘤与结瘤相关菌Paraburkholderiasp.（E）和固氮菌Paraburkholderia sp.（NFB）处理的Mimosa scabrella根生长的特定根系长度（A）。特定根长与丛枝菌根真菌定植的总根系长度（B）。

3 微共生菌的丰度和功能

没有接种微生物的处理没有出现根瘤或AMF定殖，表明没有被污染。接种固氮菌Paraburkholderia sp.的Mimosa scabrella出现了根瘤，而接种结瘤相关的Paraburkholderia sp.未出现根瘤。尽管统计学上的根瘤数量没有的显著差异，但结瘤相关菌Paraburkholderiasp.的接种降低根瘤数(p>0.045)，而接种Rhizophagus intraradices的处理比接种Paraburkholderia sp.的处理显著增加了根瘤数。在有Rhizophagus intraradices的情况下，平均每株植株有156个根瘤。然而，当同时存在结瘤相关的Paraburkholderia sp.时(图3A)，结核数量减少57.7%。在不考虑Rhizophagus intraradices的情况下,与结瘤相关菌Paraburkholderia sp.导致根瘤数减少但不影响根瘤的总干重(图3B)。

单独接种固氮Paraburkholderia sp.和Rhizophagus intraradices时，氮素浓度不受影响。(图3C)。然而，在所有双重接种的其他处理中，氮浓度平均增加了42%。Rhizophagus intraradices和固氮Paraburkholderia sp.单独接种时，氮素含量分别比对照提高88.9%和55.6%(图3D)。然而，在双重接种处理中，氮含量比对照处理增加了422%，比单独接种处理的平均值增加了203%。这种双重接种对氮浓度和氮含量均表现出协同效应(p<0.001)，其中，氮浓度和氮含量分别比两种细菌单独接种加对照的总和提高了64.7%和269%(图3C和3D)。与之相反的是一种结瘤相关菌Paraburkholderia sp.对氮浓度和氮含量无显著影响，证实不是固氮菌(图3C)。

图3 接种丛枝菌根真菌（M）、非结瘤与结瘤相关菌Paraburkholderiasp.（E）和固氮菌Paraburkholderia sp.（R）对Mimosa scabrella生长的影响。（A）根瘤数，（B）根瘤干重，（C）氮浓度和（D）植物氮含量。

在所有接种处理中，Rhizophagus Inarjadices在Mimosa scabrella的根上均有定植。与任一类型的Paraburkholderia sp.共同接种均显著增加了根的总定殖率(图4)。然而，当所有微生物都存在时，AMF的总根部定殖率比双重接种Rhizophagus intraradices和固氮Paraburkholderia sp.的处理降低了50%。(图4)。

图4 丛枝菌根真菌与非结瘤与结瘤相关菌Paraburkholderia sp.（E）和固氮菌Paraburkholderia sp.（R）处理下的Mimosa scabrella总根长。

与我们的假设相反，单独接种每种微共生体并不能始终如一地对宿主产生积极的影响，包括结瘤相关细菌和所有存在它的组合对总体微生物的产出是有害的。更具体地说，虽然结瘤菌的生长、氮的浓度和含量不受结瘤相关细菌的影响，但当结瘤相关的Paraburkholderia菌株生长时，无论是单独接种或与固氮菌联合接种，微生物丰度(即根瘤数和总丛枝菌根真菌根定殖)均降低。据我们所知，这是第一项报道结核相关细菌与同属的固氮菌和/或丛枝菌根真菌共接种时可产生种有害影响的研究。

由于研究中使用的固氮菌和结瘤相关细菌是从结瘤分枝杆菌的结核中分离出的，它们可能具有共同的感染机制。新的遗传方法揭示了结核内细菌群落的高度多样性。事实上，非固氮菌株经常在共生细菌的结核内发现，也许这是因为宿主不能特异性的识别它们，这可以解释为什么它们会在进化过程中持续存在。Paraburkholderia sp.一直被认为是植物生长促进细菌，以往的研究报导了它们作为自由生活或内生细菌固氮能力，能够溶解无机磷酸盐和抵抗真菌病原体。我们得研究表明，一些结瘤相关细菌会无回报的单方面获取资源，也就是说，它们可能充当“机会主义”或“欺骗”细菌。结瘤相关细菌已经从豆科植物如大豆中分离出来。曾有研究测试了来自大豆的15种代表性联合细菌，包括Paraburkholderia sp.，并发现他们是内生的。也有研究者证明了土壤Agrobacterium属中的非结瘤细菌能够减少普通豆类中的根瘤。

研究证明了宿主植物可以通过限制碳水合物的分配来抑制非固氮菌的结核。目前还不清楚植物是否会特异性识别结核相关细菌在结核内的不合作行为。在本研究中，我们发现，尽管结核的数量显著减少，而总结核干重不受影响，这可能表明宿主可能能够抵消非共生细菌的负面影响。因此，用这些细菌进行双重接种不会对植物的生长产生显著的影响。

一方面，我们发现了支持两种细菌建立无效相互作用的证据，另一方面，与AMF和固氮菌的双重接种导致对结瘤菌生长、氮含量和浓度的协同效应。这种协同作用与其他豆类的报告一致，如大豆(Glycine max)、豇豆(Vigna unguiculata)、普通豆(Phaseolus vulgais)和大草原豆类紫穗槐（Amorpha canescens），在可持续的低投入农业种植系统中可能至关重要。这些效应依赖于参与相互作用的物种和/或AMF和根瘤菌的特定组合。事实上，曾有荟萃分析并不支持AMF和固氮细菌在不同豆科植物中始终协同作用的假设。这表明任何协同效应都可能基于所涉及的微共生体的性质以及依赖于时空尺度，且是有宿主特异性或环境依赖性的。

根内生菌Rhizophagus intraradices的存在增加了根瘤数量。当氮和磷都受到限制时，丛枝菌根真菌可能有助于提升养分，这反过来导致更多的能量可用于氮的固定。同样，固氮菌也能提升AMF的丰度。这种“辅助效应”背后有许多种机制，包括营养、化学信号传递和激素反应。此外，AMF定殖已被证明在几种植物中诱导根结构的变化。这种影响也并不一致，例如，在Glycine max和Poncirus trifoliata中，接种AMF显著降低了根长度、表面积和体积。相反，在Vitis vinifera, Allium porrum 和Ceratonia siliqua中AMF促进了各种结构的根的生长。不同宿主的这种不一致的结果表明AMF对根构型的影响可能是植物和/或真菌物种依赖性的。 Maherali的一项meta分析表明为根的结构和AMF生长反应之间的强关系的存在提供支持。在以往的研究中，单独接种AMF不影响植物根系性状。两种Paraburkholderia菌的双重接种显著增加了根的长度、表面积和根体积。此外，观察特定的根长度(SRL)，它提供了一个成本效益指数，其中更大的SRL代表更大的根效率，能够利用更大的土壤体积每单位生物量投资，我们发现当植物与AMF和Paraburkholderia菌中的任何一种共同接种时，SRL减少了。此外，我们发现AMF定殖和SRL呈负相关，这与AMF在一定程度上取代了根在利用土壤获取养分中的作用的观点相一致，从而使根系能够在生长中投入更少的能量。事实上，菌根植物可以发展更大直径的根，帮助植物获得更多的养分，促进地上部生长获得更多的光合产物。

我们的数据首次表明，在结瘤菌属中，植物宿主、固氮细菌和AMF之间通常建立的三方共生关系对生长和营养产生协同效应。此外，我们发现从根瘤中分离的结瘤相关细菌可能对微生物适应性有害。在一个四体共生中，强调了个多体共生的复杂性和互利共生的生物学过程。这些结果有助于我们理解根结核中细菌群落的多样性和功能，这对于预期结果和继续加强植物-微生物共生的管理是至关重要的。

豆科植物可以同时与多种微生物共生，包括丛枝菌根真菌(AMF)、固氮细菌和结瘤相关细菌。然而，我们对它们的功能多样性和相互作用的理解仍然有限。本试验对这三种共生体单独接种和组合接种效应对对共生体的丰度和功能的影响进行了研究，揭示了这三种微生物的共生效应及对植物的影响，对深入探索微生物之间相互作用有十分重要的指导意义。

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