原名：High-Resolution Differentiation of Enteric Bacteria in Premature Infant Fecal Microbiomes Using a Novel rRNA Amplicon

译名：利用一种新型rRNA扩增子高分辨率鉴别早产儿粪便中的微生物群

期刊：mBio

IF：6.784

发表时间：2021.2.16

通讯作者：J. Graf

通讯作者单位：美国康涅狄格大学分子与细胞生物学系

本项目从入住新生儿重症监护病房（NICU）直至出院纵向收集婴儿的粪便样本，每周采集7名婴儿样本，包括两组胎龄在接近30周的早产双胎，他们在两个不同的重症监护病房中接受护理。同时，我们收集每个婴儿的元数据，包括抗生素治疗、任何确诊的感染、营养不良以及摄入营养来源等。我们使用约~2,500个碱基的16S-ITS-23S扩增子（StrainID）扩增子分析婴儿粪便物质中的细菌含量，以确定是否可以使用菌株特异性扩增子序列以高分辨率监测婴儿体内微生物组的发育。研究设计还包括从以前在NICU治疗的婴儿中获得的克雷伯氏菌Klebsiella分离物作为菌株水平的对照分析，以确定是否可以使用StrainID扩增子进行分离菌株的鉴别，以及能否鉴别来自同一菌株的信号。

1 StrainID扩增子能够在物种和菌株水平检测早产儿粪便微生物群中的病原体

依次采集两组早产双胎的粪便，婴儿的胎龄分别为29和30周，第一组通过阴道分娩，第二组剖宫产分娩，每组分别在不同的NICU中进行护理。我们收集了粪便样本，并使用SBanalyzer 对16S-ITS-23S扩增子进行了分析。图2展示了双胞胎婴儿A和B共享克雷伯氏菌Klebsiella spp.、大肠杆菌E. coli和肠杆菌Enterobacter spp.的情况，其中每个样本中的读长都占一半以上，这使我们能够监测菌群定植随时间的变化。

图1 从大肠杆菌E. coli基因组产生的多个StrainID扩增子。（A）圆圈代表大肠杆菌UMN026基因组，有7个16S-23S rRNA操纵子。（B）来自大肠杆菌UMN026的7个扩增子区域的多序列比对。

图2 双胞胎A/B和Y/Z的细菌群落结构。在出生后的第1周至第8周（A / B对）或第9周（Y / Z对），对两对双胞胎的粪便进行分析。双胞胎A和B与双胞胎Y和Z分布在不同医院的NICU。

与双胞胎A / B对一样，双胞胎Y / Z对中存在的细菌种类具有高度相似性，但双胞胎之间存在显着差异。双胞胎Z的第1周样本由于读取的计数低而被排除在进一步分析之外。对双胞胎Y和Z的其它样品来说，产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca和产气荚膜梭菌Clostridium perfringens含量很高，这两者与早产儿坏死性小肠结肠炎（NEC）相关。由于早产儿样本微生物群的复杂度较低，因此需要较少的读长即可准确表示最丰富的微生物群。微生物组样品的稀释性曲线图表明，对于大多数样本，即使每个物种都由多个ASV代表，几百个读长足以说明任何给定样品中存在的大多数ASV。从第1周到第3周以及抗生素治疗后的时间点的样本产生的读长相对较少，这可能是由于样本大部分是胎儿时期产生的胎粪，或者抗生素耗尽了微生物种群，导致细菌生物量较低。值得注意的是，在医院环境中常见的艰难梭菌C. difficile和肺炎克雷伯氏菌K. pneumoniae等病原体是首批在早产儿肠道定植的细菌，这些在后来的时间点才出现。

2 DADA2 -推断的ASV序列解析可区分紧密相关的克雷伯氏菌Klebsiella spp.

为了突破将单个读长映射到参考序列的局限性，我们使用DADA2进行错误校正并从这些属的StrainID测序数据中推断ASV。ASV序列不仅可以与参考基因组进行比较，还可以相互比较，以确定样本中是否包含不同于其他样本的ASV。由于两组双胞胎的几乎所有样本都含有克雷伯氏菌Klebsiella，因此它被选作新菌株分化的初始测试案例。对所有鉴定为克雷伯氏菌Klebsiella的读长进行的DADA2分析，产生了54个ASV。在24份婴儿粪便样本和3个克雷伯氏菌Klebsiella分离株K1，K7和K8中的每一个中均存在代表单个菌株“指纹”的ASV亚集（图3A）。克雷伯氏菌Klebsiella基因组通常包含8个16S-23S操纵子，对3种纯培养物的扩增子进行分析后发现，每个菌株均存在由7种不同ASV组成的独特ASV“指纹”。相对丰度的差异提示一个ASV可能存在多个副本。

图3 克雷伯氏菌Klebsiella扩增序列变异指纹图谱。（A）约2,100至2,500个碱基的StrainID扩增子序列变异体（ASV）的相对丰度热图。（B）克雷伯氏菌KlebsiellaV1中的ASV保持保守的茎环结构。

对克雷伯氏菌KlebsiellaASV指纹图谱的分析揭示了同一菌株在早产儿体内的定植过程，以及双胞胎之间分离出菌株的总体相似性。双胞胎A和B共有一个克雷伯氏菌Klebsiella ASV模式，而双胞胎Y和Z共有另一个模式，这表明每对双胞胎都被一个菌株定植，并且这些菌株在每个双胞胎中定植了至少3至7周。ASV指纹图谱强有力地证明了StrainID ASV可用于区分紧密相关的克雷伯氏菌Klebsiella，并可能在监测致病性菌株的同时，在多个个体中结合其他的毒性因素一起发挥作用。

3 ASV反映了二维rRNA结构的限制，这是对单碱基水平DADA2 ASV准确性的独立确认

作为示例，我们在图3B中的一部分16S基因V1区中描绘了所有54个克雷伯氏菌KlebsiellaASV的变异。二维（2-D）结构表明，V1茎环在60和110碱基之间的变异不是随机的，并且揭示了序列变异符合进化限制，以维持16S功能的假设。该结果与在ASV中所观察到的变异相一致，证明DADA2衍生的ASV是克雷伯氏菌Klebsiella基因组变异的准确代表，而不是PCR或测序伪像的结果。对克雷伯氏菌Klebsiella种类的研究表明，长扩增子可用于区分样品集中新的、紧密相关的物种和菌株。在扩大后的婴儿粪便微生物组样品集中，使用了相似的方法来确定肠杆菌Enterobacter和大肠杆菌E. coli的相关性。

4 肠杆菌Enterobacter ASV 指纹能够在样本中识别和追踪菌株

在图4A中，从双胞胎A、B和婴儿961样本中推断出肠杆菌Enterobacter ASV，这些样本在多个时间点均包含大量的肠杆菌Enterobacter。使用BLAST将得到的ASV映射到NCBI数据库，结果得到6个样本≥ 99％，但不完全匹配的菌株的结果。而肠杆菌Enterobacter菌株通常含有8个的rRNA操纵子，对肠杆菌Enterobacter菌株的扫描显示，有一个或多个区域可能是一个基因组的精确重复区域，导致每个基因组产生6至8个扩增子。在图4B中，从不同样品推断出的肠杆菌Enterobacter变异体经相互比对并映射回到2-D 16S rRNA结构。由于碱基变化是互补的，并且在许多不同的时间点上都保持不变，因此单碱基变化很可能是一个真正的变异体，可以用作区分ASV的有意义的区分因素。

图4 肠杆菌Enterobacter扩增子序列变异指纹图谱。（A）肠杆菌Enterobacter ASVs是在指定的几周从纵向样品中推断出来的。（B）肠杆菌Enterobacter ASV映射到2-D 16S rRNA结构。

5 大肠杆菌E. coli ASV指纹能够在样本间识别和追踪菌株

大肠杆菌通常存在于人类微生物组样本中，并且该物种包括各种菌株，其影响从良性到致病性各不相同。DADA2用于从四个双胎样本A和B以及Y和Z中，使用SBanalyzer识别大肠杆菌E. coli的读长中推断ASV，并比较所有时间点的指纹结果，如图5A。但是，双胞胎Y和Z具有两个完全不同的大肠杆菌E. coli ASV指纹。

图5 大肠杆菌扩增子序列变异指纹。（A）大肠杆菌E. coli ASVs是由SBanalyzer从两对双胞胎A/B和Y/Z的纵向样本中鉴定为大肠杆菌E. coli菌株后，在指定的时间内推断出来的。（B）大肠杆菌V6茎环处的ASV结构。

我们从4对双胞胎的16个纵向样品中获得的8个大肠杆菌E. coli ASV的序列与大肠杆菌E. coli 16S rRNA 2-D结构进行比较，在图5B中展示出了V6区域中的序列。有趣的是，双胞胎Y与双胞胎A和B共享大肠杆菌E. coli ASV 1和ASV8。对Athena数据库的搜索显示，整个大肠杆菌E. coli菌株共有许多16S-23S区域，但是几乎没有菌株共享所有区域（图6）。双胞胎A和B和双胞胎Y共享一个ASV的子集，并且他们在不同的时间被送往不同的医院，这一事实表明，他们获得的大肠杆菌E. coli菌株不同，却共有ASV的一个子集。

图6 Athena数据库中唯一可识别的克雷伯氏菌Klebsiella、肠杆菌Enterobacter和大肠杆菌E. coli基因组。

6 克雷伯氏菌Klebsiella参考数据库的基因组分类研究

为了解决测序基因组分类法产生“错误分配”的可能性，我们使用了三种方法来探索Athena数据库中克雷伯氏菌Klebsiella分类法的“正确性”，其中两种基于16S的方法，另一种基于全基因组序列的方法。Athena数据库包含458个克雷伯氏菌Klebsiella基因组，具有3,635个区域。为了评估Athena数据库中产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca序列的分类学命名准确性，我们使用16S序列和完整基因组，将Athena数据库中代表的带有16S-23S区域的产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca的10个基因组与TYGS数据库进行了比较（图7）。我们通过对10株克雷伯氏菌Klebsiella的系统发育分析，进一步探讨了16S rRNA和全基因组系统发育的差异。将所有16S rRNA基因拷贝都单独作图，以确定每个16S rRNA基因的分类（图8）。

图7 全基因组和16S系统发育分析。（a）全基因组系统发育。（b）根据16S rRNA基因序列计算GBDP距离，用FastME 2.1.6.1构建16S系统发育树

图8 数据库中10个克雷伯氏菌Klebsiella基因组的16S区分类法。

7 扩增子长度与分类鉴别的效用相关

16S rRNA基因广泛使用的~250个碱基的V4区通常可以将细菌鉴定到科或属水平。一个V1至V9（V1-V9）~1,500个碱基的16S rRNA基因扩增子通常可以在属或种水平上产生分类学特异性，但紧密相关的细菌菌株可能具有相同的16S基因。为了比较不同扩增子识别一组已知基因组的能力，我们对458个克雷伯氏菌Klebsiella、187个大肠杆菌E. coli,和109个肠杆菌Enterobacter进行了硅质比较，对扩增子进行肠杆菌菌株的扩增，扩增子覆盖V4、V1-V3、V1-V9和16S-23S StrainID区（图6）。所有三种细菌分类法的趋势表明，对于给定的属和种，大多数V4扩增子是相同的，而大多数StrainID扩增子是唯一的。

微生物组研究的主要挑战之一是传统16S rRNA扩增子测序所获得的短片段所提供的分类学分辨率是有限的。对2500 bp的16S-23S菌株的rRNA操纵子部分进行扩增和测序，并将序列与基于基因组的Athena数据库进行比较，可以对细菌种类和已知菌株进行鉴定。DADA2可用于揭示具有独特扩增子或独特扩增子组合的菌株，这些菌株会产生相应的独特ASV指纹。我们通过分析来自单个婴儿和成对双胞胎的粪便微生物组的纵向时间序列，在具有简单微生物组的早产儿中测试了这种新颖的方法。

本研究在5名婴儿粪便中检测到多株克雷伯氏菌Klebsiella，大肠杆菌E. coli和肠杆菌Enterobacter。我们将DADA2推断的可变ASV序列分配给16S分子的2-D结构，这表明碱基变化不是随机的，并且它们倾向于变化，从而可以维持已知可变区的2-D发夹环结构。从StrainID测序数据创建的ASV提供了克雷伯氏菌Klebsiella，大肠杆菌E. coli和肠杆菌Enterobacter的种和菌株级分辨率。实验设计强有力地支持了StrainID扩增子，Athena数据库和DADA2 ASV的组合所提供的更高的分辨能力，该设计包括连续几周的纵向时间序列样本，从而能够在独立采样事件中随时间独立确认新型ASV。

尽管菌株扩增子通常比单独的16S基因具有更高的分类分辨率，但仍有一些限制需要考虑。例如，即使从样本中获得的ASV与已知菌株相匹配，这也不一定证实与数据库中的基因组相同，因为紧密相关的细菌可能共享一套相同的菌株扩增子指纹，而在基因组的其他地方却存在重要的差异。另一个重要的考虑是，并非所有的ASV都必须以其相对基因组拷贝数对应的比例来表示，因为核糖体操纵子相对复制起点的距离可以在复制过程中导致驱动相对拷贝数的增加或减少。因此，如果由于生长和环境的影响，导致序列的代表性不足，来自已知菌株的ASV就可能会被遗漏。

我们使用公开可用的基因组对克雷伯氏菌Klebsiella分类研究表明，是否正确分配数据库与最佳序列匹配的分类是很重要的，并且在发布序列后是否对分类进行了重要更新也十分重要。在对新发现的细菌进行物种和菌株级分类时，应注意使新分类尽可能正确。

总之，菌株rRNA扩增子比完整的16S基因提供了更高水平的分类信息，因此可以提供整体微生物组更高分辨率的分类图像。我们以克雷伯氏菌Klebsiella，大肠杆菌E. coli和肠杆菌Enterobacter为例，证明在NICU的婴儿中，能够区分紧密相关的特定早期微生物群定植体。类似的方法也可用于利用菌株扩增子获得其他目标菌的高分辨率ASV。该实验提供了早产儿肠道中菌群定植的高分辨率纵向视图，这可能有助于跟踪治疗干预效果，并打开一个窗口，了解共生菌是如何在出生后的人类微生物组中建立的。这也可能是通过检测来确定治疗的改善情况，建立重要的共生关系，以改善患儿短期住院和长期发展的健康结果。StrainID扩增子提供了一种快速、实用、高通量和高分辨率的方法来识别和跟踪复杂环境下的肠道微生物组中的已知和未知病原体和共生细菌。

实现菌株水平的分离是微生物来源的追踪和时间研究的主要障碍。在这项研究中，我们描述了一种新型的深度测序方法，可为新生儿微生物组提供物种和菌株水平的高分辨率监测分析。以克雷伯氏菌Klebsiella，大肠杆菌E. coli和肠杆菌Enterobacter为例，我们可以在抗生素治疗后和成对双胞胎中监测它们随时间发展的动态。菌株水平的分析结合更高的测序深度和PacBio Sequel 2更低的成本，使得这种有利来源和菌株追踪分析方法可以在更复杂的微生物组中广泛实施。