原名：Molecular responses to inorganic and organic phosphorus sources in the growth and toxinformation of Microcystis aeruginosa

译名：铜绿微囊藻生长和毒素形成对无机和有机磷源的分子响应

期刊：Water Research

IF：9.13

发表时间：2021.3

通讯作者：陈秋雯

通讯作者单位：南京水利科学研究院水文水资源与水利工程国家重点实验室；长江保护与绿色发展研究所

选择M. aeruginosa (FACHB-905)作为试验藻种。在一定环境条件下使用标准BG-11培养基对购买的M. aeruginosa进行预培养。在试验开始前，通过离心收集处于指数生长阶段的藻类细胞，并置于缺乏P的BG-11培养基中培养7天以消耗藻细胞内储存的磷。

选择磷酸氢二钾作为溶解无机磷源（DIP）以及β-甘油磷酸钠作为溶解有机磷源（DOP）。根据在太湖开展的长达19年的实地调查，选择0.02, 0.2, 0.6, and 1.0 mg P/L四个不同的试验磷浓度。以0.2 mg P/L 的磷浓度作为对照组。此外，定义0.02及0.2 mg P/L为低磷浓度组，定义0.6和1.0 mg P/L作为高磷浓度组。试验总共持续18天。每隔两天分析细胞密度、光系统II的最大光合效率（Fv/Fm）以及TP、P_i、APA的水平。在试验的第8和18天，分析了不同处理中EMCs、IMCs及phoX、 pstS、sphX、 mcyA、mcyD基因。

试验数据均以平均值±标准差（SD）的形式表示，并通过SPSS22.0分析。使用Tukey多重比较检验进行多重比较分析。采用独立样本t-test比较同一浓度组在第8天和第18天的MCs浓度。P<0.05代表比较具有统计学意义。

1 M. aeruginosa的生长和光合活性

在0.02 mg P/L的DIP处理下，M. aeruginosa密度增加缓慢，并且培养14天后细胞生长进入衰退阶段（图1A）。在0.2 mg P/L DIP处理下，在培养的6-14天中发生了快速的细胞分裂，然后细胞分裂的速率下降并趋于稳定。在0.6和1.0 mg P/L DIP处理下，细胞快速分裂并持续至第18天，试验结束时最大细胞密度分别达到1.25×10⁷和1.39×10⁷个细胞/mL。当P源改为DOP时，M. aeruginosa的生长受到抑制，最大细胞密度仅为相应DIP处理的15％。当DOP被用作唯一P源时，外源P浓度越高，藻类密度的生长越慢（图1B）。在所有处理中，藻类细胞在0-14天都没有进入对数期，之后逐步下降。在DOP处理中，最大细胞密度为2.10×10⁶个细胞/ mL，直到实验结束前，该密度明显低于DIP中的水平，这说明M. aeruginosa利用DOP的能力较弱。

图1C和D展示了在不同浓度P处理下M. aeruginosa的光合活性。当DIP被用作唯一P源时，在培养的0-4天内，任何DIP浓度处理下的Fv/Fm都显著增加。在0.02 mg P/L条件下培养12天后，Fv/Fm呈逐步下降趋势；但它在0.2、0.6和1.0 mg P/L时却保持相对稳定。当DOP被用作唯一P源时，在1.0 mgP/L条件下，Fv/Fm比在培养初期就持续下降；而在其他浓度条件下，Fv/Fm比呈先增加再下降的趋势。直至培养结束，在0.02 mg P/L条件下的Fv/Fm比都显著高于其他浓度。

图1 不同处理下M. aeruginosa的藻密度和光合活性。（A）不同DIP浓度下的藻类密度；（B）不同DOP浓度下的藻类密度；（C）不同DIP浓度下的光合作用活性；（D）在不同浓度的DOP下的光合作用活性。

2 磷浓度和目标基因表达水平的变化

通过测量培养基中TP和P_i的浓度以指示M. aeruginosa对P的吸收（图2）。在前4天，所有DIP处理中的TP和Pi浓度缓慢下降，然后迅速下降。0.6 mg P/L和 1.0 mg P/L中的TP分别于8天和16天后降低到0.2 mg P/L以下。当DOP被用作唯一P源时，在0.02 mg P/L处理条件下的TP在0-8天内缓慢下降，然后缓慢上升。此外，TP在0.2、0.6和1.0 mg P/L处理中缓慢降低。在0.02、0.2、0.6和1.0 mg P/L DOP处理中，试验结束时TP分别降至0.02、0.04、0.39和0.74 mg P/L。在0.02和0.2 mg P/L DOP处理下，P_i缓慢增加，而在0.6和1.0 mg P/L DOP处理下，P_i始终保持较高浓度。P_i浓度增加到0.01、0.03、0.11和0.14 mg P/L。

图2 不同初始P含量的培养基中P浓度随时间的变化。（A）DIP的总磷浓度；（B）DOP的TP浓度；（C）DIP的PO4-P浓度；（D）DOP的PO4-P浓度。

通过qPCR分析靶基因的相对表达水平（图3）。当DIP被用作唯一的P源时，sphX和pstS基因的表达水平在0.02 mg P/L处理中显著高于对照组（0.2 mg P/L）、0.6以及1.0 mgP/L处理组。当将DOP用作P来源时，培养8天和18天后，0.02 mg P/L处理中sphX和pstS基因的表达水平显著高于对照组以及0.6和1.0 mg P/L处理中的sphX和pstS基因的表达水平。与对照组（0.2 mg P / L）相比，培养8天后，0.02 mg P/L处理中sphX和pstS基因的转录显著上调了约12倍。

图3 不同P形式和浓度下与P相关的靶基因（sphX和pstS）的转录。（A）不同DIP浓度下的sphX；（B）不同DIP浓度下的pstS；（C）在不同浓度的DOP下的sphX;（D）不同DOP浓度下的pstS。

3 APA及其基因表达

当DIP被用作唯一P源时，M. aeruginosa的APA在0.02 mg P/L处理期间逐渐增加。低浓度P会刺激产生较高的APA，这是藻类细胞对P缺乏的反应。在其他处理中，APA仅在0-10天发生少量变化，然后略有增加（图4A）。当DOP被用作唯一的P源时，在培养初期，所有处理中APA均显著增加。与初始APA（培养2天）相比，试验结束时0.02、0.2、0.6和1.0 mg P/L DIP处理中APA分别增加了4倍，3倍，2倍和2倍。同时，DOP处理中的APA分别增加了11倍，14倍，9倍和11倍（图4B）。通过qPCR分析AP基因的相对表达，结果表明在0.02 mg P/L处理中，phoX的基因表达显著高于0.6和1.0 mg P/L处理（图4C和D）。

图4 不同处理浓度下M. aeruginosa的APA和phoX的转录。（A）不同DIP浓度下的APA；（B）不同浓度的DOP下的APA；（C）不同DIP浓度下的phoX转录；（D）不同DOP浓度下的phoX转录。

4 不同处理中的IMCs，EMCs及基因表达

当DIP被用作唯一P源时（图5A），培养8天或18天后，各处理中IMC浓度没有显著差异（ANOVA，P> 0.05）。当DOP被用作唯一P源时（图5B），培养8天和18天后，各处理中IMC含量低于DIP处理。在不同浓度的DOP处理之间，IMC含量无显著差异（ANOVA，P> 0.05）。无论提供哪种P源，与培养8天时相比，除了18天时的0.02和.2 mg P/L处理，其他处理中IMC浓度均显著下降（t-检验，P <0.05）（图5A）。

当DIP被用作唯一P源时（图5C），在培养8天和18天后，EMC浓度随外源P浓度的增加而增加。在第8天，1.0 mg P/L中EMC含量明显高于0.02和0.2 mg P/L（ANOVA，P <0.05）。在第18天，经0.6和1.0 mg P/L DIP培养的细胞比0.02 mg P/L DIP处理的细胞具有更高的EMC水平（ANOVA，P <0.05）。与培养8天相比，所有DIP处理中的EMC水平在18天时均显著增加（t检验，P <0.05）。当DOP被用作唯一P源时（图5D），培养8天和18天后，EMC浓度无显著差异（ANOVA，P> 0.05）。在不同浓度DOP处理下，第8天的EMC水平略高于第18天，而在0.02 mg P/L DOP处理下，第18天的EMC水平显著提高（t检验，P <0.05）。

图5 不同P处理下（形式和浓度）的MCs。（A）不同DIP浓度下的IMCs；（B）不同DOP浓度下的IMCs；（C）不同DIP浓度下的EMCs；（D）不同DOP浓度下的EMCs。不同的字母表示统计学上具有差异（方差分析，P<0.05）。星号表示在培养8天和18天时收集的样品之间存在显著差异（t-test，P <0.05）。

图6展示了EMCs和IMCs及其对单细胞毒素产生的响应。在每一DIP处理浓度下，EMCs和IMCs的浓度与单细胞毒素产生趋势相似。在DOP处理中，IMCs含量的变化与单细胞毒素产生一致。0.02和0.2 mg P/L DOP处理中的EMC浓度变化类似于单细胞毒素产生，而在0.6和1.0 mg P/L处理中EMCs浓度降低而单细胞毒素产生略有增加。

图6 第8天的MC和单细胞毒素产生量。（A）不同DIP浓度下的IMC和单细胞毒素产生量；（B）不同DOP浓度下的IMC和单细胞毒素产生量；（C）不同DIP浓度下的EMC和单细胞毒素产生量；（D）不同DOP浓度下的EMC和单细胞毒素产生量。

通过qPCR分析了与MC生物合成相关基因（mcyA和mcyD）的相对表达水平。在DIP或DOP处理下，随着P浓度的增加，mcyA和mcyD的表达水平没有显著变化（图7）。培养8天后，DIP和DOP处理之间的mcyA基因表达没有显著差异。0.6 mg P/L处理的 mcyD转录水平显著高于0.02 mg P/L（ANOVA，P <0.05），而DOP处理之间无显著差异（ANOVA，P> 0.05）。培养18天后，在0.02 mg P/L 的DIP和DOP处理中，mcyA基因转录显著高于1.0 mg P/L（ANOVA，P <0.05）。DIP和DOP处理之间的mcyD基因表达没有显著差异（ANOVA，P> 0.05）。

图7 不同形式和浓度P条件下，与MC生物合成相关的基因转录（mcyA和mcyD）。（B）在不同浓度的DIP下的mcyD；（C）不同浓度的DOP下的mcyA;（D）在不同DOP浓度下的mcyD。不同的字母表示统计学上差异显著（方差分析，P <0.05）。

1 不同磷源对M. aeruginosa生长的影响

   M.aeruginosa可以在低浓度的DIP（0.02 mg P/L）下生长，但是随着DIP的浓度逐渐消耗到0.01 mg P/L，其生长速度减慢且光合活性下降（图1A，1C和2A，2C）。在如此低的P浓度下无法实现能量代谢和细胞合成，例如能量的回收和利用，核酸代谢中核糖体的形成以及膜和叶绿素中磷脂的合成。当DIP浓度超过0.2mg P/L时，DIP浓度的增加可显著促进藻类细胞的生长，直至第6天DIP被消耗完后（图1C）。但是，DOP浓度的增加不能促进藻类细胞的生长。培养基中的高DOP浓度（超过0.6 mg P/L）抑制了藻类生长，即使培养基中P_i的浓度约为0.12 mg P/L，藻类细胞也可以直接摄取它（图2D）。0.6 mg P/L和1.0 mg P/L DOP处理已通过培养基中的AP将DOP水解为P_i，而藻类细胞未吸收和利用P_i。这主要是因为磷酸盐转运蛋白减少，P_i可能无法转运到细胞中。

DOP培养基中的P_i来自藻类细胞的APA。本研究表明，0.02 mg P/L DIP处理的APA显著高于其他处理，并且随着DIP的不断吸收和利用而逐渐增加。同时，在每个浓度下，DOP处理的APA均显著高于DIP处理的APA（图4A和B）。这是因为藻类细胞可以在低浓度的DIP环境下上调AP合成基因，通过释放DOP中的DIP来满足浮游生物对P的需求。因此，在DIP和DOP处理中，编码AP合成的phoX在低P浓度（0.02 mg P/L）时高表达，而在高P浓度（超过0.6 mg P/L）时低表达（图4C和D ）。

细胞P代谢是一个复杂的系统，需要许多蛋白质来协调活动。在本研究中，我们发现了一个有趣的现象，无论使用DIP还是DOP作为唯一P源，pstS和sphX的表达都显示出一致的趋势。0.02 mg P/L处理中pstS和sphX的表达显著高于0.6和1.0 mg P/L DOP处理（图3）。pstS编码磷酸盐底物结合蛋白，而sphX调节磷酸盐结合周质蛋白。这两个基因都对磷缺乏敏感，并参与由二组分信号调节系统PhoB/PhoR（称为Pho regulon）控制的磷酸盐代谢。Pst系统响应P_i限制，并在高磷酸盐条件下充当阻遏物。由于基因表达，外部正磷酸盐浓度调节两种高亲和力的P-转运蛋白（sphX和pstS）。

结果表明，在高DOP浓度（0.2和0.6 mg P/L）下，P_i的浓度约为0.12 mg P/L（图2D），但在0.2 mg P/L 处理条件下，但pstS和sphX的表达量低于DIP中Pi浓度为0.2 mg P/L时的表达量（图3C和3D）。pstABCS操纵子属于pho调节子，可以将Pi从周质导入细胞质，然后在低P水平下通过自磷酸化将其激活。据推测，还有其他调节Pi吸收的运输系统的方法，例如在高DOP浓度下的Pit运输系统和Npt运输系统。因此，当高DOP浓度下细胞外Pi浓度降低时，pstS和sphX的表达不增加。因此，表达量的减少导致磷酸盐转运蛋白的缺乏。DOP培养基中的P_i不能被藻类细胞吸收，导致高DOP浓度下细胞密度降低。

2 不同磷源对M. aeruginosa毒素产生的影响

高浓度的DIP促进了M. aeruginosa的生长并增加了EMC浓度（图5C）。DIP还促进了单细胞毒素的产生（图6C）。磷浓度与自然生态系统中MC含量呈正相关，说明磷水平的升高增强了其对毒素产生的作用。DOP对毒素产生的贡献有限，这主要是由于M. aeruginosa对DOP的利用性较弱，抑制了藻类细胞生长以及MC浓度下降所致。单细胞毒素的产生增加是因为高浓度的DOP（0.6和1.0 mg P/L）抑制了M. aeruginosa的生长，由此削减了藻类细胞的数量（图6D）。MC是细胞结合毒素，当细胞受损并裂解时，毒素会释放到细胞外环境中，这解释了本研究中单细胞毒素产生的增加。尽管在DOP处理的第8天，单细胞毒素产生增加，但它对M. aeruginosa的毒素产生没有贡献。

无论DIP或DOP用作唯一P源，培养8天和18天后，各处理之间的IMC浓度均无显著差异（图5A和B）。在与MCs生物合成相关的mcyA和mcyD基因之间也未发现显著差异（图7），这一结果表明，当满足生长需要时，P的浓度不会影响MCs的生物合成途径。但是，毒素产生的速率与藻类细胞的生长速率呈正相关。EMC水平与藻类密度和P浓度的增加一致，这说明高浓度DIP可以通过调节藻类密度来刺激毒素的产生。

M. aeruginosa对P的吸收和利用具有复杂的调节机制。高浓度DIP可以促进藻类细胞的生长和毒素的产生，而高浓度DOP则不能。IMC倾向于在细胞凋亡和死亡期间释放到水中。因此，控制磷的浓度对于非营养性生物（如M. aeruginosa）至关重要。通过单独削减P、N或控制N/P的比例来预防蓝藻水华的观点引起了广泛的争论，而我们的研究则强调了控制P水平的重要性。尽管DIP被认为是首选的P源，但DOP通常代表着水生生态系统中主要的环境P源，我们的研究结果表明，低浓度DOP可以促进M. aeruginosa的生长。在富营养化和蓝藻水华产生的微囊藻毒素管控方面，不仅需要注意溶解的P的浓度，还需关注水生生态系统中P的形态组成。

低浓度DIP（0.02 mg P/L）抑制了M. aeruginosa的生长，而高浓度DIP（> 0.2 mg P/L）可以促进M. aeruginosa的生长。不论低浓度还是高浓度的DOP都能够抑制M. aeruginosa的生长。当底物浓度足够高时（DOP浓度分别为0.6和1.0 mg P/L）下，细胞表面的AP可以将DOP水解为DIP。然而，由于磷酸盐转运蛋白的表达不仅与细胞外DIP浓度有关，导致M. aeruginosa因磷酸转运蛋白不足而不能吸收自身水解产生的DIP。当细胞外DOP浓度较高时，磷酸盐转运蛋白表达下降，磷转运能力下降，导致细胞生长受到抑制。高浓度的DIP促进可以MC的分泌，而DOP的浓度不会影响MC的生产。然而，由于高浓度DOP下的P吸收不足，部分M. aeruginosa死亡并裂解，导致少量的细胞内MC释放到细胞外膜。本研究重新验查了磷在M. aeruginosa生长和MC产生中的作用，为富营养化湖泊中蓝细菌暴发的控制提供了新见解。