原名：Global Analysis of the Apple Fruit Microbiome: Are All Apples the Same？

译名：所有的苹果都是一样的吗——苹果微生物组的全球分析

期刊：Environmental Microbiology

IF：4.933

发表时间：2021.3

通讯作者：Samir Droby

通讯作者单位：以色列农业研究中心

本研究以“Royal Gala”品种的苹果果实为研究对象。在8个国家(美国、加拿大、乌拉圭、意大利、西班牙、瑞士、以色列和土耳其)的21个地点对苹果进行收获。北半球的取样地点在7-9月进行采收，南半球的取样地点在2-3月进行采收。采用标准化方案进行样本采集和处理。在每个位置中选择了不相邻的八棵树进行采样，每个位置进行八次重复。从每个苹果中取样了3种组织类型，分别为果皮、茎末端组织和花萼末端组织。使用试剂盒提取DNA，以提取的DNA为模板进行PCR扩增出细菌的16S核糖体区和真菌内部转录间隔区（ITS）。使用通用引物515F和806R结合肽核酸（PNAs）（PNA Bio）来扩增16S rRNA的V4区，以抑制核糖体和线粒体序列的扩增。使用ITS3/KYO2和ITS4引物以及定制设计的封闭寡核苷酸扩增ITS扩增子，该寡核苷酸旨在抑制宿主DNA的扩增（5'ATTGATATGCTTAAATTCAGCGGGTAACCCCGCCTGACCTGGGGTCGCGTT-C33'）。按照Illumina 16S宏基因组测序文库制备指南，使用Nextera索引试剂盒(Illumina)，进行扩增PCR后的文库制备。随后在安捷伦2100生物分析仪(Agilent)上进行文库大小、质量和适配二聚体缺失的一致性分析。使用Qiime2对阅读对进行合并、质量扩增和裁剪、ASV表生成和稀疏处理，以解决测序深度不均匀的问题。在群落组成分析之后，实验通过使用adonis (~PERMANOVA)进行了排列多变量方差分析，检验了采样国家、采样果园和组织类型之间的群落组成差异。使用微生物组包装中的核心功能，根据至少75%的调查样本中存在的属来计算样品中的核心微生物组。使用python中“Pandascorr” v 1.1.0软件包来计算样品得分。使用python中““seabornclustermap” v 0.10.1软件包对结果进行可视化。基于相关性分数生成共生网络。根据用于计算简单无向图布局的力使用Fruchterman &Reingold算法计算网络可视化和节点的位置。nx.draw函数是通过python“NetworkX” v 1.11软件包中的“pos”参数实现的。使用线性判别分析(LEfSe)发现生物标志物，LEfSe分数越高，表明每个国家的分类单元之间相对丰度差异的一致性越高。使用Benjamini-Hochberg（FDR）校正实验中的p值。

1 Royal Gala苹果的微生物多样性

去除低质量序列和苹果自身的序列后，获得了6.117.315条16S和48.528.735条ITS2阅读对，可被分配给20.072个细菌和16.241个真菌ASV。这些ASV分别对应25个细菌门和6个真菌门，分别归属于558个细菌属和822个真菌属。在实验研究的国家中，苹果真菌群落主要为Ascomycota（79.8％）和Basidiomycota（9.3％）。在Ascomycota中，诸如Aureobasidium（29.00％），Cladosporium（16.60％）和未鉴定的Capnodiales（8.80％）和Pleosporaceae（8.50％）的属占总菌群的60％以上。Sporobolomyces（5.70％），Filobasidium（4.20％）和Vishniacozyma（1.60％）是主要的Basidomycota。

研究表明，Proteobacteria（65.1％），Firmicutes（15.8％），Actinobacteria（15.1％）和Bacteroidetes（2.3％）是样品中最普遍的细菌门，占整个细菌群落的98.3％。除土耳其Firmicutes比Proteobacteria丰富外，其他国家细菌门的丰度分布基本一致。Sphingomonas（12.40％），Erwinia（11.30％），Pseudomonas（9.30％），Bacillus（7.10％），未鉴定的Oxalobacteraceae（6.80％），Methylobacterium（6.20％）和未鉴定的Microbacteriaceae（5.90％）数量最多。线性判别分析（LEfSe）的结果显示每个调查国家有90种真菌和57种细菌(图1)。土耳其的真菌属数量最多（25个），其中包括Penicillium，Zasmidium和Pseudomicrostroma。相比之下，西班牙的真菌属数量最少（5个），其中包括Monilinia、Vishniacozyma和Bensingtonia（图1a）。以色列和美国西部的独特细菌类群数量最多，而在乌拉圭采集的样本中，只有一种细菌类群被鉴定为Paenibacillaceae（图1b）。

图1 线性判别分析的圆线图显示了（a）真菌和（b）细菌类群的列表，这些列表最能代表每个地理位置（国家/地区）的微生物特征。LEfSe分数越高，表明本实验中每个国家的微生物种群之间相对丰度差异的一致性越高。

2 采样区域对苹果果实微生物多样性的影响

        苹果采样的地理位置对果实相关的微生物多样性具有重要影响（表1）。例如，采样区域对真菌和细菌的多样性有重要影响。通过香农多样性之间的成对比较表明，不论是采样国家不同还是采样国家相同但采样果园不同，真菌和细菌多样性均存在显著差异。意大利的真菌多样性最高，其次是土耳其和以色列（图2a）。而意大利，美国和瑞士采集的苹果中细菌多样性最高（图2b）。

图2 不同国家苹果果实中细菌真菌多样性的箱形图分析。

表1 采用方差分析方法研究了不同国家、果园、组织与苹果果实中的细菌和真菌交互作用产生的影响。

3 不同国家苹果的微生物群落组成

        被调查地点的地理位置对被测苹果的微生物群落组成有重要影响。尽管“国家效应”对苹果整体微生物群落有显著的影响(P=0.001)，但在真菌群落中(R²=0.375)比细菌群落(R²=0.152)中影响更明显。在基于Bray Curtis的不同相似性测试的PCoA分析中也产生类似的结果(图3a&c)。苹果受到不同果园的影响也可以解释真菌(R²=0.136,P=0.001)和细菌(R²=0.048,P=0.001)群落在不同国家的较小差异(表2)。

表2 PERMANOVA结果比较了不同地点、果园、组织对苹果果实中细菌和真菌群落的影响。

该分析基于Bray Curtis差异指标，p值使用阿多尼斯函数计算，并使用FDR方法进行了校正。

图3 基于Bray-Curtis相异距离的真菌（a）和细菌（c）群落组成的PCoA图。层次聚类的树状图显示了从不同国家（即加拿大，土耳其，以色列，意大利，乌拉圭，美国西部，美国东部，瑞士和西班牙）收集的苹果中真菌（b）和细菌（d）群落之间的相似性。层次聚类基于Bray Curtis差异，通过在R中使用“average clustering UPGMA”功能并设置k值=4来获得PCoA图，图中分支颜色对应不同的聚类。

       层次聚类表明，相对于北美东部和南美（美国东部，加拿大和乌拉圭）样品中的细菌群落，欧洲（瑞士，意大利和西班牙）样品中的细菌群落彼此更相似（图3d）。土耳其和以色列的苹果似乎有一个独特的细菌群落。真菌群落组成的层次聚类显示，从美国西部，意大利，西班牙和以色列采集的苹果与由美国东部，加拿大，乌拉圭和瑞士采集的苹果形成了单独的聚类（图3b）。此外，在同一国家的果园中采集的样品中的微生物群落更相似。以上结果在真菌群落中比在细菌群落中更为明显。

4 苹果微生物组的组织类型对多样性的影响

        不同组织类型对真菌多样性的影响无统计学意义(F=2.45,P=0.0875)。采样国家组织类型的影响，以及采样果园对组织类型之间的影响显示显著的结果(表1)。在大多数的果园中,花萼末端组织表现出更高的真菌多样性,其次是果皮和茎末端组织，只有在从乌拉圭，土耳其和西班牙采集的样品中观察到少数例外(图4)。相比之下，组织类型对细菌多样性有重要影响，而与采样位置无关(F=68.794,P=2×10⁻¹⁶)(表1)。除了加拿大采集的样品，茎末端组织拥有最高的细菌多样性(图4b)。PERMANOVA分析表明,组织类型以及组织类型与国家之间的相互作用以及组织类型与果园之间的相互作用都对真菌群落组成具有重要影响（表2）。根据从苹果花萼端部、茎端部和果皮中采集的样本的PCoA分析结果，在所有国家的所有被调查的果园中都观察到了这种影响（图5a）。在样品的细菌群落中也发现了相似的结果(图5b)。

图4 在不同苹果组织(花萼末端组织、茎末端组织和果皮)中真菌(上)和细菌(下)香农多样性的箱形图。

图5 PCoA图显示了苹果组织类型（花萼末端组织、茎末端组织和果皮）中真菌（a）和细菌（b）群落组成的变化。该分析基于CSS归一化OTU表的Bray Curtis差异指标。

5 Royal Gala苹果的核心微生物群

        苹果的核心微生物群由6个真菌属（Aureobasidium,Cladosporium, Alternaria, Filobasidium,Vishniacozyma和Sporobolomyces）与两个细菌属（Sphingomonas和Methylobacterium）组成。虽然在90%的样本中没有发现任何细菌属，但真菌属的Aureobasidium和Cladosporium在96%的样本中被发现。有趣的是，Sphingomonas的群落组成能够很好地区分大多数被调查国家的果实，并且显示出果实内的生态位特化，因为茎端、花萼端和果皮组织拥有不同的Sphingomonas群落。

       为了检测核心微生物群和非核心微生物群之间潜在的相互作用，我们通过构建基于细菌和真菌属标准化分布模式的相关矩阵来描述共生现象(图6a)。聚类模式分析表明，细菌和真菌属的核心微生物分布在两个簇中，每个簇都具有两个最主要的子囊菌属之一- Aureobasidium（绿色）和Cladosporium（紫色）。瑞士、美国和加拿大的微生物群落以Aureobasidium的相对丰度高而Cladosporium的相对丰度低为特征，而在以色列和土耳其，Cladosporium的相对丰度高，Aureobasidium的相对丰度低。核心微生物群和非核心微生物群之间存在显著的相互作用，平均结点度分别为19.125和12.23。核心微生物和非核心微生物群相互作用形成的网络有142条边相一致，分别连接8个核心微生物和60个非核心微生物(图6b)。其中Sphingomonas的相互作用达到30个，是所有微生物中最多的。利用该网络，我们可以确定微生物群落中核心微生物和非核心微生物之间潜在的有用关系(图6b)。例如，Methylobacterium与Burkholderiales呈正相关，Burkholderiales包括已报道的生物防治药剂，与已知的苹果病原体Podosphaera呈负相关。这些共生关系可以分别表明物种间合作和竞争的相互作用，并可以为实验设计服务来评估体外和果实上的这些相互作用。

图6 苹果果实微生物组的核心和非核心微生物的丰度分布的相关矩阵。“平均”链接用于层次结构聚类。树状图在h=0.8时剖切来将树状图分为五个组。对角线上的黑色正方形表示核心微生物，红色字体(a)表示核心微生物的相互作用。共现网络呈现涉及核心微生物的相互作用。核心和非核心微生物分别由星形和圆形节点表示。绿线和红线分别表示两个节点之间的正相关（r>0.4，p<0.01）和负相关（r <0.4，p<0.01）。每个节点的大小与节点的度（与该节点关联的边数）成正比。图中颜色与面板中的五个组相对应。黑框突出显示了核心细菌（Methylobacterium）与潜在的生物防治剂（Burkholderiales）和病原体（Podosphaera）之间的正负相互作用（b）。

本研究旨在全面分析苹果果实中的微生物群，并确定收获时不同果实组织上微生物群落的结构和多样性。结果表明，核心微生物群的成员可能随着苹果的驯化过程进行共同进化，并可能在果实抗病和品质性状的筛选中发挥重要作用。我们分析了“Royal Gala”苹果果实收获成熟期的微生物群落特征，并评估了地理位置对大尺度空间变异(即不同国家)和小尺度空间变异(即果实内部)的影响。虽然与植物相关的微生物组已经得到了广泛的研究，但对于果实内部微生物组的了解还相当有限。此外，也缺乏关于果实微生物组对采前和采后病害以及果实生理的作用的研究。

苹果因采后的病原体而在存储，运输和市场中遭受很多损失。30多年来，基于微生物制定苹果生物防治策略的研究已经得到了相当多的关注。特别是随着酵母菌拮抗剂的使用，该研究领域受到了大量的关注。目前已开发了几种以单一拮抗剂为基础的采后生物防治产品。由于在商业条件下效果不一致，这些产品的大规模使用受到了限制。在这方面，需要了解水果表面自然发生的微生物群及其功能，将有助于开发新的采后疾病控制生物策略。

一些研究报道了生物防治剂在水果保鲜过程中的种群动态。本研究为了解苹果表面微生物的结构和功能提供了基础。此类信息是朝着开发有效的生物学方法进行采后疾病管理的必不可少的步骤。例如，调节肠道微生物组以改善人类健康的研究已从单纯接种有益细菌（益生菌）到含有特定代谢产物的补充剂，后者提供了可供有益细菌选择性利用的资源，成为益生菌和益生元的组合，可以更有效地改变现有宿主细菌群落的组成。同样，在苹果根际，通过控制土壤微生物群来治疗苹果再植病害的研究表明，直接改变资源环境比接种单一菌株更能成功地控制病害。这些研究将提高我们对调控有益微生物群落组装的机制的理解，并制定在原位调控有益微生物群落的策略。

细菌性病害对农业的威胁越来越大，因此本文探索了苹果果实中微生物群落的组成。通过对不同国家的苹果进行取样并对果实中微生物群落的结构和群落组成进行了研究。本文还讨论了不同国家和不同组织对微生物群落的多样性的影响。为更好的了解苹果内微生物的结构和功能提供了数据支撑，并为研究生长在苹果中的微生物的复杂相互作用奠定了基础。