2022年5月20日，我们关于分子伴侣Spy作用机制的一篇论文在Nature Communications上正式发表（https://www.nature.com/articles/s41467-022-30499-x）。这是我回国工作后的第一个课题，文章的一作何为也是我的第一个博士生（现为博士后），一直以来很想记录一下这篇论文背后的故事，现在终于是动笔的时候了。

这个课题的缘起还得从一次偶然的结构预测说起。Spy是大肠杆菌周质中的一个分子伴侣，2009年我在密大Bardwell实验室读博的时候鉴定到了它，我们的合作者解了它的晶体，发现只有第29-124号残基能够形成螺旋结构，N端的28个残基以及C端的14个残基都是无序区域。毕业后我继续在Jim组做博后，2012年的某天突发奇想的把Spy的序列用网上各种结构预测软件跑了一遍，想看看它无结构的末端预测出来是什么样子。果不其然，软件给这两个极为灵活的末端预测出了一堆可能的构象，感觉它们可以随意摆动。但其中有一个竟然预测N端从Spy的凹面（也是底物结合表面）穿了过去（下图，青色loop，IntFold预测），真的很让人惊讶！当时我就在琢磨这个真的有可能实现吗，形成这种构象不会影响Spy与底物的互作吗。因为当时一直没有搞明白Spy如何在不依赖外界能量输入的情况下释放底物，隐隐约约就有一种预感，这个N端序列可能跟底物释放是有联系的。但是当时手头还有其他工作，仅凭一个预测的构象就提出这个假说也不太充分，所以这个想法当时就暂时搁置了。

2014年初我回国建立了自己的实验室，Jim很慷慨，允许我继续进行Spy的相关研究，而他当时的兴趣点在于Spy如何介导底物形成正确结构，对N端的功能完全不感兴趣。所以，我就把探索N端是否能够促进底物释放作为了实验室的首个课题之一，另一个则是Spy的生理底物鉴定。我当时也很幸运的得到了时任院党委书记的庄老师、任国重室主任的许老师的支持，每人动员了一个硕士生过来我课题组，结束了我光杆司令的状态。何为和白灵作为大师兄、大师姐，分别承担了这两个课题。在实验室成立之初，他们的课题走了不少弯路，这也促使了他们结下了同甘共苦的深厚情谊，在毕业后终于喜结连理，这是后话了。等2016年实验室终于开始走上正轨后，我们的一系列生化实验也有了较为明确的指向，发现N端肽段存在与否确实能够影响Spy释放底物的速率，找到了其中起作用的关键残基，并且通过体外实验，证明了外加的N端可以干扰Spy与底物的相互作用。这些结果够写一篇小的文章了，但我那时候心高气傲，觉得离证明“Spy通过N端肽段与底物竞争性结合Spy凹面，来促进底物释放”的假说还差得远。结果就是何为被我“忽悠”成功决定转博，想要拿到更多的N端和Spy凹面能够直接相互作用的证据。

万没想到，转博之后的研究就没有这么顺了。一开始我们尝试了测相互作用的各种方法，都检测不到。后来我们想到了利用核磁共振，来捕捉这种可能非常微弱的相互作用。当时的我对核磁的了解仅停留在样品制备的层面，是个不折不扣的小白。好在上海有个国家蛋白质科学中心，负责人吴斌老师异常爽快，几次沟通后很快就给我们安排了机时，并且手把手的教了不少数据分析方法。核磁实验是这个课题的转机，果然加入N端肽段后，检测到了Spy残基化学位移的变化，预示二者是存在相互作用的！但是，一个新的问题又摆在了我们面前，N端与Spy的解离常数在mM级别，而且等我们测定了单独的N端在Spy上的结合模式之后，发现跟Jim他们刚发表的底物的结合模式并不是十分相像！这就比较郁闷了，作用模式不同，怎么去竞争呢？

屋漏偏逢连夜雨，此时已经到了17年底，是我到单位的第四年了，而何为比我还先来半年，很快就要超正常的学制。此时除了白灵硕士毕业发表了一篇文章外，实验室没有其他文章发表，已经影响了我继续拥有博导的资格，也让我连续在绩效考核中接近末位。四年没有做完一个课题，如果我还在Jim实验室，会觉得只要有良好进度都不是什么太大的问题，但在当时的情况下，我也没有信心在一年内能够收集完讲清整个故事的全部数据，并且在何为的学制内顺利发表出来。在巨大的压力下，我们做了一个现在看来也许不那么明智的决定：暂缓把主要精力放在这个课题上，让何为先解决毕业问题。就这样，何为一边整理一些Spy突变体数据并补实验准备另外成文，另一方面零敲细打继续推进这个课题。

回到课题本身，我们觉得溶液中单独的N端的作用模式与它和Spy相连时的作用模式也许并不相同，直接测量后者或许才是破局之道。于是，我们求助了第二位合作者，清华大学的薛毅老师，由他的学生黎欣明借助分子动力学模拟做一些预测，后又借助顺磁弛豫增强技术进行一些测量。这期间的进展不一一细表，其中发生了两件高兴的事情，一是我和何为在18年的时候带着这项工作去参加了冷泉港会议，与领域内的同行进行了广泛的交流，还与当时NSMB的主编Ines Chen套了下磁。二是何为在19年顺利答辩，获得了毕业证。郁闷的是，因为文章问题，还不能授予学位，也就没有办法以博士后的身份继续开展工作，只能以自聘科研助理的身份留在实验室。另外，我们直接表征与Spy相连的N端与凹面主体的相互作用也获得了成功，显示了与底物类似的作用模式！

到了20年，何为的第一篇关于Spy文章结合底物机制的文章终于被JBC接收了；21年，第二篇关于Spy生理底物的文章被mBio接收。这让他经过八年抗战，终于获得了学位！这个过程很好的磨练了他的心态，后面其他的实验就更加顺利了。21年十一之后我们把文章投了出去，同时预计了reviewer可能会有的一些问题，开始补充实验。在C-N系列转了一圈后，主要是因为缺乏“broad interest”被诟病，最后接到了NC抛来的橄榄枝，两轮返修后，最后终得以接收。在NC的周期算起来差不多有半年之久，从投稿、返修到5个月后拿到了编辑给的条件接收函，又因为标题跟reviewer杠上了，一个月后等来正式接收函。不知道为什么，拿到接收函的时候心里无比平静，已经没有了最开始发文章的那种雀跃感。

从12年的灵感一现，到22年终于发表文章，这期间有10年之久。现在反思起来，如果实验室建立之初，我集中人手主攻这个课题，也许能省下几年的时间，但头几届的学生中有些可能就会失去挑大梁的机会，独立承担课题的能力有所欠缺。如果在17-18年的时候，我跟学生都顶住压力，把宝全部押在这个课题上，也许何为能够提前一点凭这一篇文章就获得学位，但也有可能因为压力过大而适得其反。如果没有疫情的影响，与新冠、健康相关的研究也不会成为绝对的热点，我们这样的基础研究或许会有更多的期刊认可，发表的周期也许还能够提前。但不管怎么说，这个课题从最开始的灵感一现，到后面一步步证明并修正假说，不断遇到困难又解决困难，终于填上了Spy工作循环机制中的最后一个坑，除了科研上的收获，也伴随着个人心态的成长。而何为从一开始的懵懂，到转博阶段下定决定还是要多学点东西，到科研品味提升后不愿意随随便便发文章，到成为实验室当之无愧的顶梁柱，充满想法干劲十足，我也是很为他高兴的。

也许NC也知道这个课题是我的真爱吧，选了5.20这天正式上线。

最后，这个课题要感谢太多的人。课题的两位一作何为和欣明自不用说，吴老师、薛老师对这个工作起到了巨大的推动作用，更是把我带入了NMR这个迷人的领域。感谢许老师、庄老师给了我最初的支持，感谢许老师这么多年来一直关心何为的发展。还要感谢何为父母的理解和家人的支持，第一个学生这么久才拿到学位其实让我心里挺愧疚的，这也成为了我今后更加优化人才培养策略的一种动力。

全舒

2022-5-22

于上海