aBIOTECH | 王文团队及合作者利用CRISPR/Cas9技术编辑MsMLO1基因创制抗白粉病紫花苜蓿新种质

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是全球种植面积最大、营养价值最高的饲草作物，被誉为“牧草之王”。由真菌豌豆白粉菌引起的白粉病是苜蓿最具破坏性的叶部病害之一，在国内外主产区普遍发生，严重时导致叶片早落、干物质产量下降20%~40%，品质也显著降低。尽管化学防治有一定效果，但成本高、环境污染和抗药性等问题日益突出，培育抗白粉病品种是苜蓿产业可持续发展的重要需求。

近日，三杰牧草（杨凌）研究院有限公司联合西北工业大学生命科学与技术学院王文教授团队和中国科学院西双版纳热带植物园陈江华研究员团队在aBIOTECH 发表了题为“CRISPR/Cas9-mediated knockout of MsMLO1 confers enhanced powdery mildew resistance in alfalfa”的研究论文。该研究在紫花苜蓿中利用CRISPR/Cas9技术定向编辑MLO家族成员MsMLO1，获得了对白粉病具有强效且持久抗性的4等位基因纯合突变体，且未影响植株正常生长发育，为苜蓿抗病分子育种提供了重要的基因靶点和种质资源。

紫花苜蓿是同源四倍体，基因组复杂。同时遗传转化效率低、基因编辑难度大。本研究在MsMLO1第一外显子中四个等位基因共有的保守序列设计sgRNA，克隆至含SpCas9表达盒的编辑载体中（图1A），通过农杆菌介导法转化苜蓿品种‘敖汉’，共获得26株潮霉素阳性转基因植株。

对转基因植株目标位点进行Sanger测序初步筛选后，为进一步明确突变类型及编辑效率，对含靶点突变的样品进行了扩增子测序分析。T0代中，Msmlo1-1和Msmlo1-2为杂合突变体（分别有3个和2个等位基因被编辑），Msmlo1-3为纯合突变体（4个等位基因全部被编辑）（图1B）。突变比例分析显示，Msmlo1-3中约73.83%的reads为2-bp或4-bp缺失（移码突变，导致蛋白提前终止），仅26.17%为6-bp框内缺失；而Msmlo1-1和Msmlo1-2中功能丧失型等位基因比例依次递减。纯合突变体中功能丧失型等位基因占比最高，与其最强的白粉病抗性表型一致，提示即使部分丧失MsMLO1功能，也能赋予植株有效的白粉病抗性。

为检查敲除后的表型，研究者分别对Msmlo1-1、Msmlo1-2、Msmlo1-3和野生型植株进行人工喷雾接种白粉菌（孢子浓度2×10⁵个/mL），并在接种后的3、7、14 天采集叶片进行脱色和台盼蓝染色，于光学显微镜下统计单位叶面积菌丝数和分生孢子密度（图1C-D）。接种3天后，野生型叶片上已形成快速发育的白粉菌吸器，菌丝延伸且部分出现分支；而纯合突变体叶片上未见菌丝生长；接种7天后，野生型菌丝大量伸长、分支增多，形成更多吸器；突变体仅见稀疏菌丝；接种14天后，野生型菌丝形成密集网络覆盖整个叶片表面，分生孢子密布；突变体菌丝扩展极为有限，分生孢子密度显著降低。肉眼观察也清晰可见，野生型叶片密布白色粉状孢子层（尤其叶背），而突变体叶片几乎无症状（图1E）。这些结果从组织学和组织病理学双重层面，证实了Msmlo1-3纯合突变对白粉病具有强大且持久的抗性。

为了评估MsMLO1敲除是否会对植株正常生长和农艺性状产生不利影响，研究者将突变体和野生型同等条件下种植。结果显示，Msmlo1-3在株高、鲜重、分枝数和茎节数等关键农艺指标上与野生型均无显著差异（P > 0.05）（图2）。

为解析MsMLO1介导抗病性的分子机制，研究者对野生型和Msmlo1-3突变体在接菌后14天的叶片样品进行了转录组测序（RNA-seq），每个处理设置3个生物学重复。通过差异表达基因（DEGs）分析，富集到多个关键通路和调控因子（图1F）：转录因子家族：MYB、AP2/ERF、WRKY等已知参与植物免疫的转录因子家族成员出现差异表达，提示它们可能是MsMLO1介导抗性通路中的重要节点；植物激素信号通路：水杨酸、茉莉酸、乙烯等防御激素相关基因表达改变，提示系统获得性抗性（SAR）和诱导系统抗性（ISR）可能参与其中；细胞壁重塑与次生代谢：与木质素、纤维素、胼胝质沉积相关的基因差异表达，可能增强细胞壁物理屏障功能；活性氧（ROS）代谢：ROS产生与清除相关基因变化，与早期防御反应中的氧化爆发相吻合；其他生物学过程：光信号、钙信号、生长发育、DNA/蛋白质修饰、转运蛋白及防御响应等多个通路均被富集（图1F）。上述结果表明，MsMLO1突变所引发的抗病表型并非单一通路改变，而是调动了植物体内一套广泛的免疫调控网络。

该研究首次在同源四倍体紫花苜蓿中实现了对MsMLO1基因的高效CRISPR/Cas9编辑，并获得白粉病强抗且农艺性状正常的突变体。该成果不仅填补了豆科牧草中MLO功能研究的空白，也为后续利用基因编辑进行抗病紫花苜蓿新品种培育奠定了坚实基础。

该研究得到了广东三杰牧草生物技术有限公司下属分公司三杰牧草（杨凌）研究院有限公司、中国科学院战略性先导科技专项（XDA26030301）以及国家自然科学基金（32170360等）的支持。在三杰牧草（杨凌）研究院有限公司实践的西北工业大学博士生侯倬廷、李棋、宗航，以及三杰牧草（杨凌）研究院有限公司员工王永强为本文共同第一作者，西北工业大学王文教授和中国科学院西双版纳热带植物园陈江华研究员为共同通讯作者。

引用本文：

Hou Z, Li Q, Wang Y, Zong H, Zhao W, Dong Y, et al. CRISPR/Cas9-mediated knockout of MsMLO1 confers enhanced powdery mildew resistance in alfalfa. aBIOTECH 2026:100075.

https://doi.org/10.1016/j.abiote.2026.100075

aBIOTECH已于2026年1月正式转至Elsevier以金色OA模式出版，最新投稿地址：

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