aBIOTECH | 万建民/谭俊杰团队报道水稻超迷你CRISPR-Cas12f基因编辑工具

CRISPR/Cas介导的基因组编辑技术在生物研究和作物改良领域引发了颠覆性的变革。虽然目前最普遍使用的是源自化脓链球菌的CRISPR/Cas9系统，但其较大的核酸酶分子量和特定的NGG PAM序列识别限制，使其在某些应用场景中受限。为了克服这些限制，近年来，研究人员已经挖掘并开发出了多种微型Cas效应蛋白作为基因组编辑工具。其中，来自于嗜热细菌（Acidibacillus sulfuroxidans）的AsCas12f，仅有422个氨基酸，且识别TTR(R=A/G) PAM序列，是目前已知的最紧凑的Cas核酸酶之一。然而，野生型AsCas12f在植物中的编辑效率极低。最近的研究成功创制了两种AsCas12f变体：enAsCas12f-YHAM和enAsCas12f-HKRA，在哺乳动物细胞中展现出更高的编辑效率，但其在植物中的表现和效率还有待进一步探索。

近日，南京农业大学万建民院士团队谭俊杰教授课题组在aBIOTECH发表了题为“Efficient genome editing in rice with miniature Cas12f variants”的研究论文，首次探究了AsCas12f及其变体在水稻中的基因编辑活性，并指出其在植物小片段DNA定点删除方面的应用潜力。

为了测试AsCas12f系统的植物基因组编辑能力，作者构建了三种编辑载体：野生型AsCas12f+sgRNA、变体enAsCas12f-YHAM+sgRNA_DS3–5_v7和变体enAsCas12f-HKRA+sgRNA_DS3–5_v7，并分别在水稻三个内源靶点上进行了测试。结果表明，相较于野生型AsCas12f，两种变体AsCas12f-YHAM和AsCas12f-HKRA在三个水稻测试靶点均能不同程度地提高编辑效率。AsCas12f-YHAM在OsPDS和OsD14中的编辑效率达到了4%和25%，而在OsYSA中没有发现编辑事件。AsCas12f-HKRA在OsPDS、OsYSA、OsD14中的编辑效率分别达到了27.1%、24%和53.1%。研究发现，AsCas12f-HKRA显示出更好的底物序列相容性和更高的核酸酶活性。

图1 超迷你CRISPR-Cas12f有效实现水稻基因组编辑

此外，AsCas12f变体主要诱导DNA片段缺失。缺失位置主要集中在从PAM位置开始的第12、13、23和24位，产生缺失片段的大小主要为10 bp和11 bp。该系统独特的缺失模式表明其在植物小片段DNA定点删除方面的潜力。本研究进一步扩充了植物高效基因组编辑的工具箱，为在农业领域实现精准遗传修饰提供了重大的应用价值。

南京农业大学在读硕士生叶争妍、何诗淇以及张元燕老师为该论文共同第一作者，万建民院士和谭俊杰教授为共同通讯作者。该工作得到农业生物育种重大项目、南京农业大学三亚研究院引导资金项目、江苏省自然科学基金项目、钟山生物育种实验室项目以及江苏省“双创人才”项目的资助。

引用本文：Ye, Z., Zhang, Y., He, S. et al. Efficient genome editing in rice with miniature Cas12f variants. aBIOTECH (2024). https://doi.org/10.1007/s42994-024-00168-2

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