文章题目：A novel virulence plasmid encoding yersiniabactin, salmochelin, and RmpADC from hypervirulent Klebsiella pneumoniae of distinct genetic backgrounds

文章链接：doi: 10.1128/aac.00935-23

发表时间：2023.10

发表期刊：Antimicrob Agents Chemother

IF：4.1

研究背景：已有的研究显示高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）主要存在两种可能的毒力质粒（KpVP）——KpVP-1和KpVP-2。其中KpVP-1携带高毒力相关基因iuc1、iro1、rmpA和rmpA2，以IncHI1B/ IncFIBκ型的pLVPK（AY378100）为代表；而KpVP-2携带iuc2、iro2和rmpA基因，以IncFIBκ型的Kp52.145 plasmid II（FO834905）为代表。本研究在肺炎克雷伯菌中发现了一种新型的毒力质粒，它与KpVP-1、KpVP-2型的覆盖度相对较低，于是作者将这一类质粒归为KPVP-3型。

研究对象：携带新型毒力质粒的hvKp菌株35和36

研究方法：药敏检测（AST）、拉丝试验、大蜡螟幼虫感染试验、巨噬细胞杀伤试验、全基因组测序（WGS）、比较基因组圈图、比较基因簇分析、接合转移实验、质粒消除试验、质粒稳定性检测

主要研究内容及结果：

1、药敏分析

从住院的血流感染儿童患者中分离的肺炎克雷伯菌35和36表现出相似的抗菌药物敏感性，除氨苄西林不敏感外，它们对各种常用抗生素均敏感。

2、毒力潜力

实验结果显示，肺炎克雷伯菌分离株35、36均具有高毒力表型。

① 拉丝试验：35、36的拉丝均大于10 mm，两者具有高粘表型。

② 大蜡螟幼虫感染试验：实验组35、36的48h大蜡螟幼虫存活率低于高毒H27和低毒L51对照组，表明分离株35和36的毒力比后者更强。

③ 巨噬细胞杀伤试验：感染后1h和3h，35、36和高毒对照H27的存活率显著高于低毒对照L51，表明分离株35和36具有较高的巨噬细胞杀伤抗性。

3、基因组特征

多位点序列分型（MLST）和荚膜分型结果表明，分离株35、36来自不同的遗传谱系。菌株35属于ST29、K54，而菌株36属于ST111、K63。Kleborate分析结果显示两者携带yersiniabactin相关位点，但并未在染色体上发现该ybt基因簇。除固有的blaSHV基因外，两者不携带其他获得性耐药基因。

4、质粒遗传背景

菌株35携带两个质粒，pKP35_vir和pKP35_2。pKP35_vir全长191233 bp，复制子类型为IncHI1B/FIBκ，携带毒力相关基因rmpADC（rmp1）、iroBCDN（iro1）和ybt位点（ybt4）。其ybt4位点以可移动元件IS1和Tn2为界。pKP35-vir与质粒pLVPK（KpVP-1）的一致性为99.91%，覆盖率仅为35%，与Kp52.145 plasmid II（KpVP-2）的一致性达到98.94%，覆盖率为37%（表1）。这些数据表明，pKP35_vir是一种新型毒力质粒，在本研究中作者将其归为KpVP-3质粒。菌株36仅携带质粒pKP36_vir。pKP36_vir全长191559 bp，与毒力质粒pKP35_vir高度同源，一致性为99.90%，覆盖率为99%。两者的区别主要在于，与pKP35-vir相比，pKP36-vir上有一个包含40个ORF和iroBCDN位点的37 kb区域发生了倒置（图4）。pKP35_vir和pKP36_vir均携带接合转移相关基因traF和traH，且两者均未携带pLVPK-like的重金属抗性基因。基因组数据表明，pKP35_vir-like KpVP-3质粒是一种新型的高毒力质粒，编码耶尔森菌素、沙门菌素和RmpADC。为进一步了解肺炎克雷伯菌中KpVP-3的流行情况，作者通过NCBI数据库和江苏省随机选取的88个临床肺炎克雷伯菌基因组来估计KpVP-3在全球和地区的流行程度。结果显示，88个临床菌株均未携带KpVP-3质粒。而在NCBI数据库中，pM186-2与pKP35_vir共享100%的覆盖率，且存在另外7个质粒与pKP35_vir具有≥80%覆盖率和>99.7%的一致性。这些质粒具有相同的质粒骨架，但它们携带的毒力基因并不完全相同（表1 -VG列）。此外，它们的ST分型和来源地也存在差异。这些数据表明，KpVP-3型毒力质粒可在不同遗传背景的肺炎克雷伯菌中传播，且这种新型毒力质粒可能发生了基因重组事件（表1）。

5、质粒转移及稳定性分析

① 接合转移实验：毒力质粒pKP35-vir和pKP36-vir均不能发生接合转移，可能是由于它们携带的接合转移元件并不完整。

② 质粒消除试验：未能成功消除质粒毒力质粒pKP35-vir和pKP36-vir。

③ 质粒稳定性检测：菌株35、36传代7天后均未发生毒力质粒丢失，表明pKP35-vir-like毒力质粒在肺炎克雷伯菌中能够稳定存在，其对菌株35和36的适应性成本可能没有显著影响。

文章结论

本研究发现的新型毒力质粒KpVP-3携带高毒力相关基因rmpADC（rmp1）、iroBCDN（iro1）和ybt位点（ybt4），可在肺炎克雷伯菌中稳定存在，不可发生接合转移。目前这种质粒的全球流行率很低，但它能够存在于肺炎克雷伯菌的多种不同遗传背景菌株中，因此具有较高的流行传播潜力，值得密切关注。

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