在高通量测序（比如RNA-seq）中很重要的一块就是检测基因的表达量，基因表达量计算和差异表达分析是转录组数据分析的基础。与qPCR类似，转录组数据基因表达量的衡量也是采用相对定量的方法。那么，到底该如何定量呢？

假设通过比对得到了A,B,C,D四个基因在3个样本中的read counts，如下表，那么，可以用比对到参考基因的reads数来衡量不同样本基因的表达量吗？能否认为样本1中gene B比gene C表达量高吗？或者gene B在样本3中比样本1表达量高吗？

 表1 不同基因比对得到的reads个数

 答案当然是不可以。原因主要有两点：

① 基因长度的影响。

在同一个样本中，基因越长，随机打断得到的片段就越多，该基因被测到的概率就越大，比对到该基因的reads就越多。

② 测序深度的影响。

不同样本中，样本的测序深度越高，同一基因被测到的次数越多，比对到该基因的reads就越多。

为了能进行不同样本不同基因间的比较，就需要给这些数据同样的“起跑线”，类似物理学的参照系。简单来说也就是将该基因的read counts除以总reads数和基因长度，消除测序深度和基因长度的影响。于是就有了常见的RPKM、FPKM、TPM等标准化方法。

RPKM  

RPKM（Reads Per Kilobase Million）:即Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads。

计算公式：

RPKM= total reads/mapped reads(Million) /length(kb)

total reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；

mapped reads(Million)：某个样本的所有reads总和（以Million为单位）；

length(kb)：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以kb为单位）。

下面是依照公式计算上表中基因的RPKM值（注意：为了便于显示，这里将公式中的Million改为100）：

 表2 不同基因的RPKM值的计算结果（“M”为100时）

FPKM  

FPKM（Fragments Per Kilobase Million）: Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments

FPKM和RPKM的计算方法基本一致，只不过把reads换成了fragments。对于单末端测序数据，由于Cufflinks软件计算的时候是将一个read当做一个fragment来算的，故而FPKM等同于RPKM。

对于双末端测序，如果一对paired-read都比对上了，那么这一对paired-read称之为一个fragment；而如果只有一个比对上了，另外一个没有比对上，那么就将这个比对上的read称为一个fragment。而计算RPKM时，一对paired-read会当成两个read分别计算。

关于Fragments和Reads的区别见下图：

TPM  

TPM（Transcripts Per Kilobase Million）：Transcripts Per Kilobase of exon model per Million mapped reads

而TPM 的计算公式：

TPM=(Ni/Li)*1000000/sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)

Ni：mapping到基因i上的read数； Li：基因i的外显子长度的总和

一个样本中某基因的TPM值的计算方法：先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正后的这个基因read数(Ni/Li)与校正后的这个样本的所有read数（sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)）求商。

下面是依照公式计算上表中基因的TPM值（注意：为了便于显示，同上，将公式中的100万改为100）：

表3 不同基因的TPM值的计算结果（“M”为100时）

不管是计算FPKM、RPKM，还是计算TPM，我们需要一个Read Count的数据矩阵（行为基因，列为样本）。在计算TPM是先对基因长度进行标准化，之后再对列进行标准化。

这样使得最终的TPM矩阵的每列总和都相同（1M），也就是说每个样本中的TPM的总和都是一样的。理论上，这使得我们更容易比较不同样本中所占同一基因的read数的比例。

备注：在进行microRNA表达分析时，往往不考虑碱基长度的影响，因为miRNA的长度范围大部分集中在21-23nt，差异不大，但原理上大家要弄懂。

总结：

不管是计算FPKM、RPKM，还是计算TPM，我们都要先得到一个Read Counts的矩阵（行为基因，列为样本）。在计算FPKM和RPKM时，都是先按列（也就是这个样本的总read数）进行标化，之后再对对个基因的长度进行标准化。而TPM是先对基因长度进行标准化，之后再对列（这个时候就不再是这个样本的总read数了）进行标准化。这样使得最终的TPM矩阵的每列都相同，也就是说每个样本中的TPM的和都是一样的。这样就会使得我们更容易去比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。而RPKM/FPKM由于最终的表达值矩阵的列和不同，故而不能直接比较同一个基因在不同样本中所占的read数，需要再换算成比例。

转载自

http://www.360doc.com/content/19/0315/12/19913717_821662843.shtml

http://www.360doc.com/content/19/0315/12/19913717_821662274.shtml