Ka/Ks分析是生物信息学常见分析之一，它在研究核酸分子进化方面有重要应用。计算Ka/Ks的意义在于理解蛋白编码序列的亲缘关系，重建系统发育，分析选择压力，是基因家族分析中十分重要的一部分。

什么是Ka/Ks？

在遗传学中，Ka/Ks表示的是两个蛋白编码基因的非同义替换率（Nonsynonymous substitution rate，Ka）和同义替换率（Synonymous substitution rate，Ks）之间的比值。通过这个指标可以判断是否有选择压力作用于这个蛋白质编码基因。

举例来说，如果手头有两个不同物种的同一个基因的序列，比如人和小鼠的p53基因，将这两个基因的序列进行比对，你会发现这两段序列有差异（进化！）。再仔细观察，你会发现有些碱基的变化导致了编码氨基酸的变化（非同义替换），有些没有导致编码氨基酸的变化（同义替换）。这是由密码子的简并性造成的，因为3个碱基决定1个氨基酸，而64种碱基组合决定20种氨基酸，所以会有冗余出现。一般情况下，第三个碱基变化会造成同义替换，而第一、第二个碱基的变化会造成非同义替换。

Ka和Ks的计算公式：

Ka = 非同义替换SNP数/非同义替换位点数， 即非同义替换率

Ks = 同义替换SNP数/同义替换位点数， 即同义替换率

其中，非同义替换位点数就是会造成氨基酸变化的位点数的总和，比如编码丝氨酸（Ser）的第一二位碱基。而同义替换位点数就是不会造成氨基酸变化的位点数的总和，比如编码丝氨酸的第三位碱基。对于像第一个方框里面的苯丙氨酸（Phe）和亮氨酸（Leu）这种情况，第三位碱基的变化有50%的可能造成氨基酸的变化，则在计算非同义替换位点数和同义替换位点数时，各计为0.5，相当于平分这一位点。另外，计算Ka/Ks时，不考虑start codon和stop codon。

好了，现在回到上面的人和小鼠的p53基因的例子。我们只需要数一下两个序列发生（非）同义替换的SNP数，再除以总的可替换位点数，就得到了Ka和Ks值，继而得到两者的比值。

原理似乎很简单，然而，实际计算并不简单。

上面的计算方法没有考虑不同碱基之间替换速率的不同。比如，嘌呤之间替换的概率（A→G）要高于嘌呤替换为嘧啶的概率（A→C/T），也就是说转换（transition，嘌呤变嘌呤，嘧啶变嘧啶）发生的概率要高于颠换（transversion，嘌呤变嘧啶，嘧啶变嘌呤）发生的概率。很多计算方法都会考虑到这些替换发生概率的不同。

另外，如果两个物种的分化时间较长，情况更为复杂，可能会影响Ka/Ks的比值。比如有一个位点，原来是A，后来变成T，再后来又变成C，虽然发生了两次替换，但仅有一次被用于计算替换率。再比如有一个位点，原来是A，后来变成T，但同时与它相对应的另一个序列的位点，也发生了A到T的替换，那么我们也无法用上面的方法来计算替换率。对于这些复杂情况，我们可以用最大似然法来计算替换率，这里不再详述。

Ka/Ks和进化有什么关系？

如果一个基因没有受到自然选择压力，那么根据中性选择理论，非同义替换率和同义替换率应该是相同的。一般来讲，因为非同义替换会造成氨基酸变化，可能会改变蛋白质的构象和功能，因此会造成适应性的变化，从而带来自然选择的优势或劣势（一般是劣势）。而同义替换没有改变蛋白质的组成，因此不受自然选择的影响（这里我们忽略密码子偏好性的影响）。总之，ks能够反映进化过程的背景碱基替换率，而Ka/Ks的比值能够说明这个基因受到了何种选择。

长颈鹿的长脖子基因肯定是受到了正选择……

一般情况下，在某个体中偶然发生的一个碱基替换（突变），如果没有额外的好处或者坏处的话，慢慢地也就消失了。但是在自然选择中会有很多巧合，某些突变就很幸运地被保留了下来，并且被固定了（突变频率由极小变为100%）。一个这样的突变在二倍体种群中被固定的可能性为1/2N，其中N是种群大小。在这种情况下，非同义突变被固定下来的可能性与同义突变的可能性相同。也就是说，在没有受到自然选择压力的情况下，基因的Ka/Ks比值接近1。

小鼠和大鼠的835个直系同源基因的Ka/Ks比值的频率分布

但实际上，这个比值远小于1，因为一般非同义替换带来的都是有害的性状，不能被固定下来。但好消息是，某些具有特殊功能的基因处于强烈的选择压力之下，例如某些与病原共同进化的免疫基因，它们的某些结构域的Ka/Ks比值很可能远大于1，这就给我们提供了一种启示。

于是，我们有了下面的分类：

Ka/Ks＞1，基因受到正选择（positive selection）

Ka/Ks=1，基因中性进化（neutral evolution）

Ka/Ks＜1，基因受到纯化选择（purify selection）

Ka/Ks比值能做啥？

人和黑猩猩的基因组只有约1.09%差异，染色体的数目及形态几乎没有变化，但是仔细去看的话，会发现很多染色体片段的重排，也就是重新洗牌。2003年发表在Science的一篇研究发现，发生重排部位的基因，受到正选择（Ka/Ks＞1）的比例要显著高于没有发生重排部位的基因，这说明染色体重排与基因功能的分化密切相关，也与人和黑猩猩的分化密切相关。

人和黑猩猩染色体非重排部位（Colinear）和重排部位（Rearranged）基因的Ka/Ks分布。红色线条为Ka/Ks=1的分界线。重排部位基因受到正选择的比例更高。

当Ka/Ks＞1时，基因受到强烈正选择，这样的基因即为近期正在快速进化的基因，对于物种的进化有着非常重要的意义。我们可以根据Ka/Ks比值筛选部分基因，然后做后期的功能研究，这种方法已经被普遍应用到分子进化研究领域。

除了查找快速进化基因，Ka/Ks还能用于检测基因的功能性，因为假基因（pseudogene）的Ka/Ks比值通常比功能基因更高（大家想想为什么？）。此外，Ks代表进化过程的背景碱基替换率，可用来反推事件发生的时间，如全基因组多倍化的时间，这在探究物种起源方面有重要应用。

相关文献：

Hurst L. D. (2002). The Ka/Ks ratio: diagnosing the form of sequence evolution. Trends in genetics, 18(9), 486.

Navarro, A., & Barton, N. H. (2003). Chromosomal speciation and molecular divergence -- accelerated evolution in rearranged chromosomes. Science, 300(5617), 321–324.

北大教授顾红雅老师的公开课：生物演化http://www.chinesemooc.org/live/611219

参考：

1. 搜狐https://www.sohu.com/a/204503028_761120

2. 知乎https://zhuanlan.zhihu.com/p/105910386?ivk_sa=1024320u

3. 360个人图书馆http://www.360doc.com/content/19/1112/07/19913717_872553965.shtml