孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder），又称孤独症、自闭症，是一类严重影响儿童精神健康的神经发育疾病，临床上患者通常会表现出严重程度不同的社交障碍以及重复刻板行为。根据美国公共卫生中心统计显示，孤独症的发病率呈现逐年升高的趋势，最新的2022年美国孤独症检出率约为1/36【1】. 根据最新中国对于6~12岁孤独症儿童发病率的统计显示，男孩发病率约为0.44%~0.95%，女孩发病率约为0.12%~0.30%【2】。根据研究报道，遗传因素是孤独症致病的最主要因素，近年来研究者们发现了大量的孤独症风险基因及致病突变【3,4】，目前对于致病突变导致疾病的分子细胞机制研究有一些研究，但是否可以运用精准基因编辑方法对导致孤独症的点突变进行准确的脑内修复还是尚未解决的重要科学问题。

仇子龙研究团队通过全外显子组测序技术在一例中国的孤独症患儿的MEF2C基因上发现了一个新发点突变（de novo mutation）, c.T104C, p.L35P, MEF2C基因已被证实是一个很重要的孤独症风险基因，突变会导致神经发育迟滞及一系列严重症状【5】，但是该新发点突变对于MEF2C基因功能的影响未知。研究团队首先利用分子细胞生物学的研究方法在体外探究了 L35P 点突变对 MEF2C 蛋白结构、表达以及功能上的影响及其分子机制 (图I和图II)。研究团队发现 L35P 突变会导致 MEF2C 蛋白质发生依赖泛素化蛋白酶体途径的快速降解（图II），最终显著降低MEF2C蛋白的表达水平（图I）。

图I: L35P点突变会显著降低MEF2C蛋白表达水平。

图II：L35P点突变会通过泛素化蛋白酶体降解途径介导MEF2C蛋白翻译后快速降解，且表现出dominant negative effect。

图III：Mef2c L35P杂合小鼠表现出与孤独症相关的异常神经发育，突触密度降低，抑制性中间神经元数量下降及异常的电生理表型，且会出现孤独症相关的行为学表型。

图IV： 基于CRISPR/Cas9系统开发的新型胞嘧啶单碱基编辑系统，通过体内及体外验证了其在目标靶点的碱基编辑效率以及脱靶事件，证明该系统是高效，准确且安全的。

为了研究L35P基因突变对小鼠行为学表型的影响，研究团队构建了Mef2c L35P 点突变敲入小鼠模型，并通过生物化学、免疫荧光成像以及行为学实验探究了其神经发育及行为学表型。研究发现Mef2c L35P 杂合突变小鼠大脑中存在孤独症相关的神经生理学特征以及发育异常现象，并且表现出社交障碍以及刻板行为等孤独症核心症状的行为学表型（图III）。

随后，为了修复小鼠大脑神经元中的L35P点突变，仇子龙和程田林团队合作开发了一种基于CRISPR/Cas9 的新型胞嘧啶单碱基编辑系统 （APOBEC3A embedding Cytosine Base Editor，AeCBE），使其能够将小鼠Mef2c基因中特定位置上异常的 C·G 碱基对转换成正常的 T·A 碱基对。为了能够使得新型CBE系统成功地跨越小鼠血脑屏障（blood brain barrier， BBB），研究团队将AeCBE 系统包装进PHP.eB血清型的腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）中，并且利用单次小鼠尾静脉注射AAV的递送方式，使得AeCBE系统在小鼠大脑中得以成功表达。经AeCBE系统编辑后，研究团队在体内检测到较高的单碱基编辑效率以及低脱靶事件，验证了新开发的AeCBE系统具备高效性、准确性且安全性的特点（图IV）。

最后，研究团队检测了经过AeCBE系统介导的基因治疗后Mef2c L35P突变杂合小鼠大脑中的神经生理学变化以及行为学表型。在经过单碱基编辑技术介导的基因修复后，研究团队发现Mef2c L35P突变杂合小鼠大脑中降低的Mef2c蛋白表达水平得到恢复，并且其社交障碍以及重复刻板性行为也得到了明显的改善。

本工作提出了一种利用 CRISPR / Cas9 介导的单碱基编辑系统在全脑水平修复致病基因单核苷酸突变的体内基因编辑策略，从而为各种大脑遗传疾病提供新的治疗方案和思路。

上海交通大学医学院松江研究院/中国科学院脑智卓越中心仇子龙研究员和复旦大学脑科学转化研究院程田林研究员为该论文共同通讯作者。中国科学院脑智卓越中心李维克博士，复旦大学脑科学转化研究院博士生张淑倩为该论文共同第一作者。

中国科学院脑智卓越中心彭婉玲博士、石玉含博士、袁博博士、袁依婷、王锦程博士、韩文建博士、陈枝芳、单仕芳、上海交通大学医学院附属第九人民医院薛震宇、复旦大学脑科学转化研究院陈金龙博士、张成以及复旦大学脑科学研究院薛碧清对该工作做出重要贡献。

该研究工作得到了中国科学院脑智卓越中心许晓鸿研究员、竺淑佳研究员、徐华泰研究员和复旦大学脑科学研究院邰一琳研究员的重要指导。该研究工作还得到了中国科学院脑智卓越中心分子细胞平台，实验动物平台与光学成像平台大力支持。

上海交通大学医学院松江研究院仇子龙研究员实验室（https://www.shsmu.edu.cn/sri/kxyj/yjdw1/js/czl.htm ）长期致力于孤独症的神经生物学研究工作，从孤独症的遗传学分析、分子神经生物学研究与基因编辑干预等方面开展工作，长期招收相关专业博士后，请有志学子与仇子龙研究员直接联系（qiuzilong@shsmu.edu.cn）。

复旦大学脑科学转化研究院程田林研究员实验室（https://itbr.fudan.edu.cn/info/1202/1805.htm）致力于基因编辑技术研发及各类遗传病基因治疗研究，长期招收相关专业博士后，请有志学子与程田林研究员直接联系（chengtianlin@fudan.edu.cn）。

相关论文信息：

10.1038/s41593-023-01499-x

参考文献