视网膜神经节细胞（Retinal ganglion cells，RGCs）是视网膜的输出神经元，位于视网膜的内层，其胞体和树突位于视网膜，而轴突却延伸至大脑内多达五十多个区域，是连接大脑与外界的桥梁，负责将图像或者非图像的信息以动作电位的形式从视网膜传递到大脑。在视网膜神经退行性疾病如青光眼中，RGCs是主要损伤的细胞类型。因此，对RGCs亚型进行细致定义可为进一步疾病细胞图谱的研究奠定基础，具有重要的临床意义。

RGCs共有的特征是都具有很长的、延伸至大脑的轴突，这些轴突组成了视神经、视交叉以及视束，然而在树突、对视觉刺激的反应以及转录组方面，每种RGCs又有其独特的属性。最近已有研究分别根据形态、光反应以及转录组特性将RGCs分成了47、32和45个类别，但目前这些不同属性所定义的细胞类别间是否具有对应的关系仍然是未知的。

膜片钳结合单细胞测序技术（Patch-sequencing，Patch-seq）技术可以做到在单个细胞中同时获得形态、电生理以及转录组信息，并已经在大脑神经元中得到应用。结合视网膜组织的特点，该研究对这项技术进行了优化。

使用优化后的技术，研究人员获取了472个具有转录组信息的RGCs，其中351个具有光反应信息、144个具有形态信息。将本研究获得的RGCs转录组对比到参考转录组图谱，可归属到43个转录组细胞类型（图1）。依据形态层级分类规则（Bae et al., Cell 2018），这144个细胞可分到18个形态类型（图2）。

图1

利用这一多模态的数据集，该研究不仅在已有研究的RGCs种类中建立转录组与功能和形态的连接，同时也揭示了未知RGCs转录组类型的功能和形态特征，如有颜色选择性的C39_Novel。具体阐述如下：

图2

在高通量单细胞转录组测序数据集中，已经发表的研究（Tran et al., 2019）根据标记基因的表达，推测出其中的一些转录组类型与使用传统方法发现的RGCs类型的对应关系，例如名为C42_AlphaOFFS的转录组应该是对应于传统的被广泛研究了的Alpha类型的RGCs。本研究部分印证了这些推测。例如，名为C16_ooDS_DV的转录组类型，被推测为具有方向选择性的ON-OFF RGCs。在本研究收集到的Patch-seq数据集中，转录组归属到C16_ooDS_DV的RGCs，其光反应恰好为ON-OFF且具有方向选择性（图3）。

而形态上，这部分RGCs属于37*型，其树突具有明显的双分层且分别与位于GCL层和INL层的星爆无长突细胞的分支重合，这些都是ON-OFF方向选择性RGCs的特点。说明了Patch-seq数据集在预测已有研究的RGCs种类方面的可靠性。

图3

对于已知转录组类型（在高通量单细胞测序数据中，这些转录组类型都以已有的RGCs种类命名，如上文所述的C16_ooDS_DV）的准确注释证明了该方法在为未知的转录组类型（在高通量单细胞测序数据中，这些类型的名称都以“Novel”结尾）提供注释方面的可靠性。本研究为19种Novel的转录组类型提供了形态和功能注释。例如，对于转录组归属到名为C10_Novel的细胞，该研究发现都是呈现ON反应，且形态均归属于7i/7o类型。这些细胞都具有树突面积较大、树突在内丛状层呈现单分层且与位于GCL层的星爆无长突细胞的分支重合的特点。如转录组归属到名为C39_Novel的细胞，在形态上归属于5si类型，具有树突面积较小但复杂度较高、分支点较多的特点，其树突广泛分布于内丛状层的中间，提示这类细胞可能参与加工高分辨率图像；

而在功能上，这部分细胞呈现出在蓝光下为ON-OFF、在绿光下为ON的颜色选择性特点（图4）。再如转录组归属到C34_Novel的细胞，虽然形态上树突也分布在内丛状层中层附近，但功能上却都呈现为ON反应。

综上，这种转录组-形态-光反应的一致性，提示在RGCs中可能存在结合转录组-形态-光反应的统一分类标准。

图4

中山大学中山眼科中心、眼科学国家重点实验室为第一单位。中山大学中山眼科中心的黄婉静、许强、粟静、唐磊、郝赵哲为本论文共同第一作者，中山大学中山眼科中心的刘胜研究员、刘奕志教授和刘峰博士为共同通讯作者。

相关论文信息：

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.111322