基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术已经被广泛用于功能基因研究和作物遗传改良，但传统的基因编辑系统对调控DNA序列功能解析及应用仍有局限性。

植物基因组中有多种多样的调控元件、功能基序以及非编码DNA，例如启动子顺式作用元件、miRNA编码序列、上游开放阅读框序列（uORF）、具有调控功能的基因间区。

这些DNA序列在调控基因表达、转录翻译等方面发挥重要作用，也是目前基因功能研究与遗传改良的重点目标区域。

由sgRNA引导的Cas9核酸酶可以在基因组靶位点处产生DNA双链断裂（DSB)，细胞通过非同源末端连接(NHEJ）修复，往往容易形成1~3个核苷酸的插入或缺失突变。

然而，这种插入/缺失突变很难有效地破坏调控DNA的功能，然而，经典的CRISPR/Cas9不能有效对上述重要DNA功能元件进行操纵。

因此，开发新型、精准、可预测的多核苷酸删除基因组编辑系统对调控DNA序列的功能解析及应用具有十分重要的意义。

高彩霞团队长期致力于植物基因组编辑新技术的研究和开发，本研究中，研究人员基于胞嘧啶脱氨以及碱基切除修复（Base Excision Repair, BER）原理，首次将野生型SpCas9与胞嘧啶脱氨酶APOBEC、尿嘧啶糖基化酶(UDG)以及无嘌呤嘧啶位点裂合酶(AP lyase)组合，建立了新型的多核苷酸靶向删除系统。

图1：AFID系统在植物中介导精准且可预测多核苷酸删除。(a) AFID系统工作原理示意图。(b) AFID系统的不同构建形式(AFID-1~3、eAFID-3)。(c) AFID-3与Cas9之间可预测删除比例的比较。(d) AFID-3与eAFID-3可预测删除类型的比较。(e) AFID-3介导的水稻可预测多核苷酸删除突变体与1~2 bp插入缺失突变在白叶枯病抗性上的差异。

研究人员表示，考虑植物细胞本身存在BER体系，他们首先利用高脱氨活性的APOBEC3A脱氨酶构建出3种形式的AFID系统（AFID-1~3），并在水稻和小麦细胞中对多个内源DNA靶点进行测试。

结果显示，AFID-3介导的删除效率高达33.1%, 且产生从不同的5’-胞嘧啶到Cas9切割位点间的多核苷酸删除，可预测的删除比例高达30%以上。

接着，研究人员进一步对不同胞嘧啶脱氨酶进行筛选，发现截断的APOBEC3B脱氨酶（A3Bctd）不仅有较高的脱氨活性，同时还具有一个更窄的脱氨窗口。

将A3Bctd替换AFID-3系统中的A3A，从而开发出eAFID-3系统。eAFID-3更高效地介导从偏好TC基序的脱氨位点到Cas9 切割位点之间的可预测删除，效率是AFID-3的1.5倍。

此外，研究组利用AFID-3系统靶向水稻OsSWEET14基因启动子上的效应子结合元件，获得了多核苷酸删除的突变体植株，经白叶枯病接种试验发现：相较于1~2 bp的插入缺失，该系统产生的多核苷酸删除水稻突变体对白叶枯病菌的抗性更强。

研究结果表明，AFID系统具有高效、精准、可预测等优势，该系统的建立可为植物基因组调控DNA的功能研究及设计育种提供了一个强有力的基因组编辑工具。（韩扬眉）

相关论文信息：

DOI: 10.1038/s41587-020-0566-4