该研究开发了一个高效的捕获特定RNA结合蛋白双链RNA底物的建库测序技术（irCLASH）以及后续的一整套生物信息学分析方法。

基于该方法，作者对人类RNA编辑核心蛋白ADAR的细胞内双链RNA底物进行检测，首次在转录组水平上系统地绘制了ADAR蛋白的内源双链RNA底物图谱。

通过对ADAR双链RNA底物进行系统的生物信息学分析及实验验证，作者揭示了决定ADAR结合效率和编辑效率的底物特征和ADAR结合长双链RNA的体内模型。

ADAR蛋白家族能结合到特定RNA的双链区域，并催化A碱基发生脱氨基反应生成I碱基，导致A-to-I RNA编辑。

A-to-I RNA编辑是动物中最普遍的RNA编辑类型，广泛的参与转录水平和转录后水平的多种基因调控机制，比如在转录组水平改变氨基酸序列，调控mRNA剪切、mRNA稳定性和环状RNA形成等等。 

此外，目前针对特定位点突变导致的疾病主要从基因组水平修复。

比如CRISPR/Cas9系统直接从基因组水平修复突变位点，但这一系统在DNA和RNA水平都有脱靶效应，并且Cas9蛋白本身会刺激细胞免疫反应，这些都限制了其临床应用。

相比于DNA编辑，定点RNA编辑具有可控和可逆性，不影响基因组稳定性，并且可以只导入RNA而非蛋白，不会诱导免疫反应，在临床上具有一系列优势。

目前已有多个研究利用特定的导向RNA招募ADAR蛋白进行定点RNA编辑，但是这一领域最大的问题之一是RNA编辑效率低。

揭示内源ADAR如何有效地识别和编辑底物可以用于指导和优化RNA靶向编辑系统。

尽管刻画ADAR蛋白的内源RNA底物具有重要的意义，但由于技术的局限性，目前研究人员对ADAR内源底物的特性及A-to-IRNA编辑的强度如何通过双链RNA的结构和碱基组成精细的调控所知甚少。

基于CLASH (crosslinking, ligation, andsequencing of hybrids) 的原理，作者通过TSAP酶和T4 PNK的组合使用以及新型接头的使用，提高了RNA分子间的连接效率和双链RNA底物的得率，使得研究人员可以在2天内完成整个irCLASH的建库流程（图1）。

同时，针对在建库过程中，双链RNA的两条序列的连接具有双向性的特点，作者开发了相应的分析流程，进一步提高了双链RNA底物的得率。

另外，作者利用ADAR的双链RNA和单链底物进行组装拼接，进而得到了完整的、全长双链RNA底物。

图1：irCLASH的建库流程。

与之前根据计算推导的研究设想不同，作者发现ADAR具有大量的、长距离的双链RNA底物。

作者还发现不完全互补配对的底物跟ADAR蛋白也有很好的亲和度，特别是ADAR2家族成员。

一般来说，一个底物双臂之间的距离越长，其底物的双链结合区域就越长，但是双臂的距离长度跟底物的配对程度没有太大的相关性。

通过对全转录组水平ADAR底物的一系列生物信息学分析及实验验证，作者进一步揭示了决定ADAR结合效率和编辑效率的底物特征。

最后，作者意外地发现ADAR蛋白能够串联结合于双链RNA底物上，并且相邻两个蛋白分子间大约间隔50bp，通过这种串联结合可以提高其RNA底物的编辑效率。

基于上述发现，作者提出了一个ADAR结合长双链RNA的协同结合模型，这一模型为长双链RNA编辑效率较高这一现象提供了一个可能的分子水平的解释（图2）。

图2：ADAR结合和编辑长双链RNA底物的3种可能模型。其中模型C（协同结合模型），符合我们全转录组ADAR底物分析结果。

总而言之，作者通过开发irCLASH测序技术及后续的整套生物信息学分析方法为研究双链RNA结合蛋白的内源底物提供了新的工具。

利用这一工具，作者捕获和刻画了RNA编辑核心蛋白ADAR家族每个成员的内源双链RNA底物，揭示了决定RNA编辑位置和强度的特征，为研究ADAR的功能、调控机制等后续研究提供了基础。

同时，该研究揭示的ADAR与底物相互作用及催化特性为研究人员开发高效的RNA定点编辑工具提供了资源宝库及改进方向。

论文信息：

DOI：10.1038/s41594-020-0398-4