文献来源：Genetic Alterations and Their Relationship in the Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Pathway in Thyroid Cancer，Clin Cancer Res 2007;13(4).（影响因子9.0）

摘要：

目的：本研究的目的是探讨甲状腺肿瘤PI3K/Akt信号途径中基因变异的发生及其相互关系，探讨以PI3K/Akt信号途径作为甲状腺癌治疗靶点的精准范围。

实验设计：人的甲状腺肿瘤组织样本共303个（包括86个FTC、86 个PTC、50 个ATC和81个BTA）。用PCR方法检测PI3K/Akt信号途径中常见的基因变异（包括PIK3CA拷贝数增加，PIK3CA、Ras和PTEN基因突变）发生的频率，考察不同变异之间的相互关系。

结果：

1.基因变异频率分析:上述基因变异出现任何一种的概率因组织类型不同而不同。在良性甲状腺腺瘤（BTA）中占31% (81例中有25例），在滤泡性甲状腺癌（FTC）中占55% (在86例有47例），在乳头状甲状腺癌（PTC）中占24%（86例有21例），在间变性甲状腺癌（ATC）占58%（50例中有29例），其中以FTC和ATC组织中最为常见。

2.基因拷贝数分析:PIK3CA基因的拷贝数增加伴随着PIK3CA蛋白表达量增加。

3.不同基因变异的关联性分析:在BTA、FTC和PTC肿瘤组织中，不同的基因变异具有相互排斥性，表明在分化的甲状腺肿瘤发生过程中它们各自通过PI3K/Akt途径独立发挥作用。然而，随着肿瘤由分化类型向未分化的ATC类型发展，这些基因变异的共存也越来越多。在PTC和ATC组织中这些基因变异经常与BRAF突变同时出现。

结论：在甲状腺肿瘤的发生发展过程中，尤其是在FTC和ATC组织中，PI3K/Akt通路经常异常激活。随着PI3K/Akt通路上基因变异的积累，BTA组织逐步向FTC和ATC组织类型发展。PI3K/Akt通路相关基因变异以及BRAF突变共同促进PTC组织向ATC组织类型发展，PI3K/Akt信号通路可能是甲状腺癌的主要治疗靶点。

1、材料与方法

1.1 材料

人的甲状腺肿瘤组织样本共303个，包括86个FTC、86 个PTC、50 A个TC和81个BTA。

1.2 DNA提取

从石蜡包埋的组织样品中分离DNA：在室温下用二甲苯处理样本8-10小时后去除石蜡，用1% SDS和0.5mg/mL蛋白酶K在48⁰C消化样本组织48h，同时加入少量的浓缩蛋白酶K以促进消化。随后采取标准苯酚氯仿提取法和乙醇沉淀程序分离DNA。

1.3 PIK3CA基因的拷贝数分析：实时荧光定量PCR法

本文利用实时荧光定量PCR技术评估甲状腺肿瘤PIK3CA基因拷贝数增加值。试验在ABI 7900HT仪器上进行，反应条件与以前发表的论文相同 (22)。每个样本重复检测三次。

引物探针序列如下表：

从正常白细胞中提取DNA，连续稀释后建立标准曲线，浓度范围为0.01-20ng。PIK3CA基因的拷贝数增加值限定为一个大于或等于4的数字。

1.4 PIK3CA、Ras、PTEN和BRAF基因的突变分析

本研究根据文献选出PIK3CA、Ras、PTEN和BRAF基因的突变位点，通过PCR方法进行分析,PCR产物通过测序予以确认。PCR分析方法如下：

为了验证这些基因的PCR效率和质量，首先用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，然后用循环测序试剂Big Dye terminator V 3.0（Applied Biosystems）对PCR产物进行直接测序。循环参数如下：95⁰C为30 s，95⁰C为15 s，50⁰C为15 s，60⁰C为4 min，35个循环。为了对突变进行确认，最后将样本送往约翰霍普金斯生物合成和测序中心用ABI PRISM 3700 DNA分析仪（应用生物系统）进行分析。

1.5 免疫组化染色

进行免疫组化染色是为了调查肿瘤中PIK3CA蛋白表达与PIK3CA基因拷贝增量的关系。具体方法是，将15mm石蜡包埋的组织切片脱蜡，酒精浸泡，在3%过氧化氢中孵育，根据抗原暴露增强液制造商的说明加入抗原暴露增强液在微波炉中处理15分钟（载体实验室，Burlingame）使内源过氧化物酶灭活。将组织切片与PIK3CA的抗体蛋白一起在4⁰C下孵育过夜，用Vectastain Universal Quik kit试剂盒进行染色（矢量实验室）。用3，3-二氨基联苯胺显示过氧化物酶活性，采用盲法（即，评分者不知道病例的PIK3CA基因拷贝数）对每个病例的免疫组化染色强度进行评分。

1.6 统计分析

样本平均数采取方差不相等成组t测验进行分析。对于少于五个案例的数据采用双尾Fisher精确检验。PIK3CA拷贝数与免疫组化评分的关系采取线性回归分析进行。P值<0.05被认为是显著的。

注：数据为发病率，n（%）。

*1例拷贝数分析失败，因此患病率为85例中24例（28%）。

a.1例PIK3CA突变分析失败，因此患病率为5/85（6%）。

b. 1例拷贝数分析失败，因此，患病率为34/171（20%）。

X.1例PIK3CA突变分析失败，因此，患病率为8/171（5%）。

K.2例拷贝数分析失败，患病率为20/48（42%）。

图1.不同甲状腺肿瘤组织中PI3K/Akt通路的基因变异

A、不同甲状腺肿瘤中PIK3CA基因的拷贝数。柱高，平均值；横条，标准差。**，P=0.01；***，P<0.001。

B、PI3K/Akt途径中所有基因变异的累加患病率，包括PIK3A拷贝数增加（4个或更多）和各种甲状腺肿瘤中PIK3CA、PTEN和Ras基因的突变。各列顶部的值，患病率（%）。TF代表PI3K/Akt通路与甲状腺肿瘤相关的基因变异总频率（当这些基因变异发生时）。CF代表PI3K/Akt通路与甲状腺肿瘤的两个或多个相关基因变异的共存频率。

图2.PIK3CA的免疫组化： PIK3CA拷贝数增加与PIK3CA蛋白表达量增加的相关性

A，甲状腺组织切片用抗PIK3CA抗体进行免疫组化染色。随着PIK3CA拷贝数（括号内数字）的增加，特异性染色（棕色）的程度增加。病例a，正常甲状腺组织；病例b～d，滤泡性甲状腺癌。随机抽取28份标本，用线性回归分析免疫组化评分与PIK3CA拷贝数的关系。两者之间有显著的相关性（R=0.72，P=0.01）

表3.PIK3CA基因拷贝增加与PI3K/Akt通路甲状腺肿瘤基因突变的关系

注：特定基因突变的病例数/指示PIK3CA拷贝数增加状态的病例数。

'*'和'+'分别表示存在和不存在PIK3CA拷贝数增加。

t表示双尾Fisher精确检验。

图3. 甲状腺肿瘤个体中PI3K/AKT通路的不同基因变异的分布：Y轴表示与甲状腺肿瘤个别病例（圆）对应的PIK3CA基因拷贝数。其他遗传事件（即突变）分别用不同颜色表示：红色、绿色和蓝色分别表示Ras、PTEN和PIK3CA突变。空白圆，缺少突变；双色圆，由相应的颜色表示的两种类型的突变共存。

表4.PI3K/Akt途径基因变异的分化型甲状腺肿瘤个体病例总结：基因变异的互斥性（续）

图4.甲状腺肿瘤发生发展过程中PI3K/Akt通路作用的简化模式图。该模式图阐明了PI3K/Akt和MAP激酶两种主要的信号通路，它们分别在FTC和PTC的肿瘤发生中起主要作用。-到--到---表示PI3K/Akt通路的作用增强。圆圈颜色强度的增加代表肿瘤的进展和侵袭性的增加。MAPK通道，Ras→Raf→MEK→MAP→ERK通路。