II NIR荧光和SOG的氧化还原响应

在细胞内，CFN-gel中的二硫键通过氧化还原反应裂解释放Ce6分子，从而诱导荧光发射和SOG的生成。当用5 mM DTT处理CFN-gel时，其荧光强度较未用DTT或低浓度DTT处理的凝胶提高了4.9倍，说明二硫键断裂后，CFN-凝胶中聚集的Ce6分子可以有效释放，从而开启CFN-gel的荧光。采用singlet oxygen sensor green(SOSG)作为单重态氧检测试剂，对CFN-gel在670 nm光照下的SOG进行分析。5 mM DTT处理后，CFN-gel SOG的生成量较0或5 μM DTT处理的CFN-gel提高了1.9倍。这些数据表明，CFN-gel具有氧化还原响应荧光发射和光毒性。

图3 荧光信号的氧化还原响应开启和CFN-gel的单线态氧生成。(a)DTT处理CFN-gel 4 h后的荧光发射光谱；(b)670 nm激光照射下DTT处理的CFN-gel，SOSG荧光随时间的增加(n=4)。

III CFN-gel的SPR分析

通过SPR分析比较CFN-凝胶与VEGF-165和P-选择素的结合特性。VEGF-165与岩藻多糖和CFN-gel的平衡解离速率常数(K_D)分别为953.0和756.1 nM。P-选择素与岩藻聚糖和CFN-gel的K_D值分别为69.71和718.9 nM。

图4 表面等离子体共振(SPR)分析。

IV 体外细胞研究

CFN-gel在含血清蛋白的细胞培养基中具有良好的分散稳定性。HT1080肿瘤细胞内吞实验显示，CFN-gel被有效地内化到肿瘤细胞中，荧光淬灭的Ce6在细胞内经氧化还原响应释放后，荧光被激活。CFN-gel的细胞摄取量至少是游离Ce6的18倍。采用CCK-8法比较细胞存活率，探讨CFN-gel对HT1080癌细胞的体外治疗作用。在没有光照的情况下，试验浓度下，游离Ce6处理6h的癌细胞没有细胞毒性。同样，在0.1至2.5 μM的浓度下，观察到CFN-gel处理的癌细胞没有细胞毒性。随着CFN-gel浓度从5 μM、10 μM和20 μM增加，细胞活力逐渐下降，分别为88.3%、85.9%和60.2%。CFN-gel处理24小时进一步降低了细胞活性，而游离Ce6在高达10 μM的浓度下处理24小时，肿瘤细胞未显示任何细胞毒性作用。用CFN-凝胶或游离Ce6在不同浓度下孵育HT1080细胞6h，用670 nm，10 J/cm²的激光照射(剂量率50 mW/cm²)后，继续孵育24h，结合Ce6的CFN-gel的IC₅₀值约为2.73 μM。相比之下，游离Ce6处理的细胞在光照下没有治疗作用。

图5 游离Ce6和CFN-gel处理HT1080癌细胞的近红外荧光图像(a)；荧光强度的定量分析(b)；不同浓度的游离Ce6和CFN-gel对HT1080细胞的体外暗毒性(c)；在670 nm光照(50 mW/cm², 10 J/cm²)下的体外光毒性(d)。

V 体内近红外荧光成像

图6 选择性肿瘤成像在异种移植瘤模型中的体内评价。

VI CFN‑Gel的抗肿瘤作用

通过测定HT1080异种移植瘤模型的肿瘤生长率，进一步评价了CFN-gel联合PDT的抗肿瘤作用。CFN-gel+PDT组与PBS组、游离Ce6+PDT组和CFN-gel组相比，体内治疗效果明显增强。TUNEL实验证实了CFN-gel和光照的显著治疗效果。可能由于CFN-gel被内化到P-选择素过度表达的肿瘤血管内皮细胞中并在光照下破坏它们，导致第4组肿瘤切片的CD31染色几乎看不到血管生成性肿瘤血管。

与PBS对照组相比，单独使用CFN凝胶的小鼠在第7-10天显示肿瘤生长延迟，这可能是由于岩藻聚糖本身的抗癌潜力所致。免疫组化染色图像的定量分析显示，与PBS组相比，CFN-gel治疗组的肿瘤中CD31阳性内皮细胞的数量减少了45.3%(***P<0.001)，说明CFN-gel具有抗血管生成作用。与PBS组相比，CFN-gel治疗组的肿瘤中凋亡细胞增加了4.9倍(**P<0.01)，这表明CFN-gel在肿瘤中的累积诱导了抗肿瘤作用。

图7 CFN-gel联合PDT体内抗肿瘤活性研究。

VII CFN-gel的体内生物相容性

图8 CFN-gel的体内生物相容性。(a)第10天从不同治疗组收集的主要器官的代表性H&E染色图像；(b) PBS、游离Ce6和CFN-gel治疗组小鼠第10天的血液化学数据(n=4)；(c)不同组小鼠平均体重随时间的变化。在任何治疗组中，均未观察到明显的器官、血液生物标记物和体重毒性迹象。