写在前面

    病毒作为地球上最丰富的生物实体，影响人类生活的多个方面。土壤是病毒最大的天然储藏库，病毒通过与宿主微生物相互作用，广泛影响了土壤生态系统如影响养分循环，植物健康以及污染物降解等功能。尽管许多基于基因组学的研究报道了病毒参与土壤生物地球化学循环过程的潜能，但证明土壤病毒在养分循环方面的生态功能的实证研究仍然比较缺乏。

    近日，浙江大学徐建明教授团队通过切向流过滤系统对三种长期不同施肥处理（L：不施肥；M：单施化肥；H：化肥和有机肥混合施用）的稻田土壤病毒进行分离表征，获得了三种类型（LV; MV; HV）、不同浓度（V0; V1; V10）的病毒悬液，随后设计交叉接种的微宇宙培养试验（图1），于实验室培养8周，测定培养期间温室气体排放速率，培养结束后测定土壤养分含量、原核微生物群落以及功能基因芯片，目的是探究病毒载量和病毒来源对土壤养分循环和温室气体排放的影响及其机制。

    这项研究于北京时间2024年10月8日以题为“Impact of Viruses on Prokaryotic Communities and Greenhouse Gas Emissions in Agricultural Soils”在线发表在《Advanced Science》上，浙江大学为第一和通讯作者单位，浙江大学环境与资源学院博士生黄兴为该论文第一作者，李勇副教授和法国第戎农业研究所Laurent Philippot为共同通讯作者，剑桥大学博士后Lucas P. P. Braga和宁波大学葛体达教授等参与了此项工作。本研究得到浙江省自然科学基金杰出青年基金和国家自然科学基金等项目资助。

图 1. 实验设计图

主要结果

01

 病毒添加对土壤养分的影响

    孵育 8 周后，我们观察到病毒添加对土壤养分含量具有不同影响，具体取决于病毒载量、病毒来源和施肥历史（图 2）。方差分析显示，病毒载量显著影响土壤中的溶解有机碳 （DOC） 和氮 （DON） 含量以及铵态氮浓度 （p < 0.05）。值得注意的是，在至少一半的处理中，高病毒载量导致 DOC 和 DON 浓度增加（图 2）。DON 的浓度还受到病毒来源（即添加来自原生或非原生土壤的病毒）的显著影响 （p < 0.001），其中，只有在添加高载量的原生病毒后，施肥土壤中的 DON 才会增加（图 2）。一种解释是土壤中存在易感宿主库，当添加本地病毒时，其可以不需要适应新的宿主种群而直接侵染原有宿主库。此外，由于土壤 C/N 比远高于微生物宿主细胞中的碳氮比，因此病毒裂解释放的溶解养分对土壤氮库的影响也可能大于对碳库的影响。相比之下，病毒载量和病毒来源都不会影响总碳 （TC）、总氮 （TN） 和硝酸盐浓度 （p > 0.05）。

图 2. 不同病毒添加方式对土壤养分含量的影响

02

病毒添加对温室气体排放的影响

    总体而言，温室气体 (GHG) 的排放率表现出时间变化，CO2和 CH4的峰值排放发生在最初 7 天，N2O的峰值排放发生在第 10 至 35 天。如预期一样，土壤施肥历史是温室气体排放的重要影响因素。与未施肥的土壤 L 和土壤 M（仅用 NPK 施肥）相比，土壤 H中观察到的累积 CO2 排放量最高（p < 0.001）。（图 3a）。相比之下，土壤 H 中的甲烷和氧化亚氮排放量明显低于其他两种土壤。

    病毒载量对所有三种温室气体的排放均有显著影响（p < 0.001）。具体而言，添加高载量病毒（V10）使所有处理中的 N2O 排放量增加了 13.5% 至 187.1%， CH4 排放量增加了 13.9% 至 121.3%。相反，我们发现病毒载量对 CO2 排放的影响相对较弱，添加 V1 后 CO2 排放量略有增加，添加 V10 后排放量明显减少（图 3a），这可能是由于在添加低病毒载量后，微生物物种的群落更新加速和/或呼吸代谢增强。然而，在添加高病毒载量后，原核生物多样性和微生物生物量大幅下降，最终导致土壤呼吸引起的 CO2 排放量减少。值得注意的是，我们发现高病毒载量的这种影响主要在土壤 H 中检测到（图 3a）。这可能与具有不同施肥历史的土壤之间微生物群落的差异有关。

图 3. 不同病毒添加方式对温室气体排放的影响

    研究共检测到 26 个与碳循环相关的功能基因，其中包括 10 个与碳固定相关的基因、13 个与碳降解相关的基因和 3 个参与甲烷代谢的基因（图 4）。这些功能基因的丰度主要受土壤施肥历史的影响，但碳固定和碳降解基因的丰度也随病毒载量而发生显著变化。值得注意的是，低病毒载量处理（V1）中大多数基因的丰度高于对照（V0）和高病毒载量处理（V10），这与累积 CO2 排放量的趋势相吻合（图4a）。对编码对 CH4 排放相关的酶的基因的分析揭示了病毒载量诱导的产甲烷菌（mcrA）和甲烷营养菌（pmoA 和 mmoX）丰度的对比变化（图 4b）。具体而言，添加较高病毒载量显著增加了所有土壤中 mcrA 的丰度，而添加原生病毒后降低了土壤 M 和土壤 L 中 pmoA 的丰度。相反，与对照 (V0) 和接种较高病毒载量 (V10) 的土壤相比，接种低病毒载量的土壤中编码可溶性甲烷单加氧酶的 mmoX 基因更占主导地位 (图 4b)。

    我们还测定了四个参与氮循环过程的关键功能基因，即氮固定 (nifH)、氨化 (ureC 和 gdh)、硝化 (amoA、hao 和 nxrA) 和反硝化 (narG、napA、nirS、nirK、nosZⅠ和 nosZⅡ)。我们发现病毒载量对除gdh 和 hao 外的所有目标氮循环基因丰度有微小但显著的影响，（图 4c）。特别是在所有处理中加入高病毒载量后，亚硝酸盐氧化过程的反应最强烈，nxrA 增加了 1.41 至 3.91 倍（图 4c）。相比之下，病毒来源仅对 nifH、amoA 和 narG 基因的丰度有显著影响（p < 0.05）。

图 4. 不同病毒添加方式对碳氮功能基因丰度的影响

03

病毒添加对原核微生物群落的影响

    原核微生物群落的特征分析表明，病毒也可以深刻影响这些群落的多样性和组成。这与微生物生物量的大幅下降一致，该结果为土壤病毒实施的强有力的自上而下的控制提供了实验证据（图 5a）。虽然“杀死赢家 （KtW）”假说认为占主导地位的原核生物种群更有可能被病毒侵染，使低丰度群体增加频率并保持微生物多样性，但我们发现在添加高病毒载量后，原核微生物的丰富度和 Shannon 多样性都有所降低（图 5）。需要注意的是，溶原病毒不能使用切向流过滤进行特异性分离，这限制了我们在本研究中区分溶原病毒和裂解病毒的能力。未来可以采用丝裂霉素 C 或荧光标记技术来研究不同病毒-宿主比例下溶原病毒的分布特征。

图 5不同病毒添加方式对微生物群落的影响

    通过分析差异物种，研究发现属于脱硫杆菌门中大多数 ASV，以及属于厚壁菌门中的脱硫肠状目和脱硫杆菌科的大多数 ASV 在高病毒载量下都受到不利影响（图 6）。与这些科有关的原核生物被认为具有不同的硫代谢功能，表明病毒可能对硫循环产生强烈影响。此外，我们还观察到添加病毒后属于Nanoarchaeota的物种相对丰度显著增加（图 6）。由于我们使用最高载量灭活病毒作为对照（V0），这种积极作用并不是由于病毒颗粒中输入了可以促进原核生物生长的元素，例如碳、氮或磷。相反，病毒裂解过程中微生物细胞释放的有机物可能使剩余的嗜营养类群受益，例如变形菌门，这与“Viral Shunt”假说一致。高病毒载量对土壤 L 和 M 中微生物群落组成的影响大于土壤 H（图 5e-f）支持了这一观点，有机和矿物肥料的养分输入减弱了病毒裂解释放的有机物的效应。虽然研究无法阐明几种 ASV 相对丰度增加的潜在机制，但可能性包括整合的原噬菌体赋予宿主细胞的适应性益处。或者，杀死易受病毒感染的竞争性菌株可能导致对照处理中弱势的 ASV 的相对适应性增加。通过有针对性地去除各种细菌类群，研究人员最近证明了竞争性相互作用在土壤细菌群落组装中的重要性。有趣的是，几种受病毒添加刺激的 ASV 属于共生类群，例如纳米古菌门和厚壁菌门内的共生杆菌科。因此，需要开展更多工作来了解病毒对微生物间相互作用的级联效应。

 图 6. 不同病毒添加方式下的差异物种分布，（a） 土壤L; （b） 土壤M; （c） 土壤H。

04

病毒添加和施肥方式通过改变微生物群落和养分含量进而影响温室气体排放

    使用分段结构方程模型 (SEM)，研究测试了每种温室气体的排放是否与土壤养分、多样性和整个微生物群落组成的变化以及病毒载量或土壤施肥历史引起的功能性微生物群落丰度的变化直接或间接相关。SEM 分别解释了 CO2、CH4 和 N2O 排放的 66.2%、75.1% 和 61.8% 的变异度（图 7）。其中，土壤 CO2 排放通过微生物生物量、多样性和群落组成的变化间接受到病毒载量和土壤施肥历史的影响。甲烷和氧化亚氮排放也受到施肥历史和病毒载量的影响，但其机制与驱动土壤呼吸的机制不同。CH4 排放受到病毒载量的直接和间接影响，包括产甲烷菌和甲烷营养菌丰度的变化以及整个微生物群落的变化。相比之下，N2O 排放仅通过土壤养分和氮循环微生物群落丰富度的变化而间接受到病毒载量的影响。

图 7. 病毒添加方式和施肥策略影响了微生物群落，养分含量和温室气体排放之间的联系

写在后面

    该研究提供了病毒对农田土壤微生物群落和生物地球化学循环影响的实验证据。结果表明，病毒侵染会影响土壤微生物生物量、多样性和组成，从而对生物地球化学循环和温室气体排放产生影响。其中，病毒添加通过影响总体微生物群落进而影响土壤呼吸，通过影响功能微生物群落进而影响甲烷和氧化亚氮的排放。此外，该研究结果强调了土壤施肥策略在调节土壤微生物群落和生物地球化学过程对病毒侵染响应的重要性，添加有机肥可以有效降低微生物群落对病毒侵染的负面影响。该研究首次挖掘了病毒侵染与农田温室气体排放之间的联系，为理解土壤生态系统中微观生命的复杂性提供了新的视角。

文章链接：

https://doi.org/10.1002/advs.202407223

第一作者简介：

黄兴，美国威斯康星大学-麦迪逊分校博士后。2024年6月毕业于浙江大学环境与资源学院，获土壤学博士学位，主要关注土壤微生物互作和病毒生态学研究。目前以第一作者在ISME、Advanced Science、Soil Biology and Biochemistry等期刊发表论文。

 通讯作者简介：

  李勇，浙江大学环境与资源学院副教授，博士生导师。2012年获日本名古屋大学农学博士学位，主要从事土壤温室气体排放的微生物调控方面的研究，主持浙江省自然科学基金杰出青年基金、国家自然科学基金4项，国家重点研发计划子课题2项。以第一/通讯作者在The ISME Journal、Advanced Science、Soil Biology and Biochemistry、ISME Communications和土壤学报等国内外期刊发表论文40多篇，授权发明专利1项。担任Frontiers in Microbiology编委、土壤学报和生态环境学报等青年编委、中国植物营养与肥料学会养分循环专业委员会和中国土壤学会青年工作委员会委员。浙江大学 “求是青年学者”和优秀德育导师，指导的研究生获国家奖学金2人次、浙江省优秀毕业生称号3人次。