点击get output。

（8）比对（此步骤耗费很长时间，可多线程并行，但不解决速度问题。我的每个重复耗时一天，则大约一周运行完。）。建立符号链接#ln -s GTF_file_path workingDirectoryPath，#ln -s Bowtie_index_filePath/* workingDirectoryPath。如果不创建符号链接，可能会报错。

# tophat -p 8 -G GTF文件路径 -o TH_输出文件的文件夹 基因组索引位置（所在文件夹/索引前缀） fq文件（可以多个，中间以空格分开）。

这一步运行完之后，会生成日志文件夹、accepted_hits.bam文件、deletions.bed文件、insertions.bed文件、junctions.bed文件、left_kept_reads.info和right_kept_reads.info文件。

（9）运行完以上程序，或每个重复运行完后，执行如下命令：

# culllinks -p 8 -o CL_输出文件夹 TH_输出文件的文件夹/accepted_hits.bam

这步运行完后，会生成四个文件：genes.fpkm_tracking，isoforms.pfkm_tracking，skipped.gtf，transcripts.gtf。

（10）整合转录组注释。

先构建一个文档文件，名为assemblies.txt，内容如下

./CL_输出文件夹1/transcripts.gtf

./CL_输出文件夹2/transcripts.gtf

./CL_输出文件夹3/transcripts.gtf

./CL_输出文件夹4/transcripts.gtf

./CL_输出文件夹5/transcripts.gtf

./CL_输出文件夹6/transcripts.gtf

然后

# cuffmerge -g GTF文件路径 -s 基因组.fa 8 assemblies.txt

漫长的等待后（一个小时）

（11）鉴定差异表达基因。

# cuffdiff -o diff_out -b 基因组.fa -p 8 -L group1Name,group2Name(注意逗号) -u merged_asm/merged.gtf ./TH_输出文件的文件夹1accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹2accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹3ccepted_hits.bam(注意粉色逗号)  （此处有空格，前边是第一组的bam文件，后边是第二组的bam文件）./TH_输出文件的文件夹1accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹2accepted_hits.bam,./TH_输出文件的文件夹3ccepted_hits.bam

漫长的等待后（大概24小时），将diff_out文件夹拷贝到windows系统，分析结果。