高通量测序可以从数百万个碱基中标记出一个突变，但按照标准操作规范，所有报告的突变必须经过一代测序验证。

NGS的强大毋庸置疑，但它并非完美无缺。这项技术本质上是将基因组打碎成片段进行测序，然后通过计算重新组装。在这个过程中，某些基因组区域会成为技术的“盲区”。

重复区域是最典型的问题。基因序列中可能连续出现7、8个相同的碱基（如AAAAAAA），当NGS的短读长跨越这些区域时，准确判断重复次数变得异常困难。

高GC含量区域是另一个挑战。GC碱基对结合更加紧密，使得这些区域在测序文库制备中难以处理，常常导致覆盖不足或完全缺失。

同源序列则难以区分。短读长无法跨越高度同源区域，难以找到唯一比对位置，算法可能比对到序列的错误位置，产生误导性结果。

染色体结构变异同样棘手，当遇到大片段的插入、缺失、倒位或重复时，NGS很难精确定位变异的起点和终点。

这些技术局限性不是理论上的担忧。而2019年《Journal of Molecular Diagnostics》的一项调查发现，一些实验室的NGS检测结果，超过2%（特别是插入/缺失）是错误的，这样的错误集中出现在上述的技术盲区。

数据集：蓝色为阳性，红色为假阳性

当NGS标记出一个阳性突变时，尤其是位于上述高风险区域的突变，一代测序仍然是无可争议的“金标准”。与NGS的间接推断不同，Sanger测序产生的是直观、连续的序列数据，以清晰的峰图形式呈现。

验证的必要性已经渗透到行业标准和指南中。美国医学遗传学与基因组学学会在其技术标准中明确指出：“对于用于临床诊断的NGS检测，应使用正交方法验证所有致病和可能致病变异。”

欧洲分子基因诊断质量联盟的指南则更加具体：“对于NGS检测到的序列变异，特别是位于复杂基因组区域的变异，应使用Sanger测序进行确认。”

在实验设计阶段，前瞻性规划验证策略。这包括在样本预算中预留验证专用材料，专门的经费和实验时间。

在数据分析阶段，实施风险分层评估。不是所有变异都需要同等级别的验证。可以根据变异类型、基因组位置和临床重要性建立分层验证方案：位于高风险复杂区域的阳性突变需要验证；新发现的且预测为目标的突变需要验证；用于指导关键治疗决策的变异必须验证。

对于临床实验室，还有额外的质量控制要求。许多认证机构要求实验室定期进行阳性样本的再验证，确保整个检测流程的持续准确性。人员培训也至关重要——技术人员必须能够正确解读Sanger测序峰图，识别可能的伪影。

Sanger测序每个反应需要额外的经费，验证流程可能使报告延迟几天到一周。但比起错误诊断带来的代价，这些成本微不足道。

一次假阳性报告可能导致不必要的治疗，甚至手术。而一次假阴性则可能让患者错过早期干预的机会。

对于研究项目，未经验证的阳性结果可能导致整个研究方向的错误，浪费数月甚至数年的工作时间。在论文评审过程中，审稿人通常也会提出这方面的要求。