Microbiomics: The Germ Theory of Everything

微生物组学：万物的细菌理论

快速、廉价的DNA测序技术现在允许科学家研究不可培养的微生物；结果挑战了生物学的一些最基本概念。--艾伦·多夫

在19世纪，一些生物学家开始支持一个明显荒谬的理论：疾病不是由每个人都知道的糟糕的卫生条件和肮脏的蒸汽引起的，而是由太小而肉眼看不见的生物引起的。从事这一奇怪想法的先驱研究人员开发了无菌培养技术，改进了显微镜，并创造了其他尖端工具。渐渐地，他们的研究结果说服了他们的同事，新的疾病细菌理论，尽管看起来很奇怪，是真的。

在21世纪，一些生物学家开始支持一种更为荒谬的理论：人类和其他大型生物并不是众所周知的个体，而是依赖数十亿微生物的完整生态系统。致力于这一不寻常想法的先驱研究人员已经开发出新颖的取样策略、强大的新基因测序和数据分析技术，以及其他创新技术。渐渐地，他们的研究结果让新一代科学家相信，生命微生物组理论，尽管看起来很奇怪，也许是真的。

加州卡尔斯巴德生命科技公司（Life Technologies）研发总监蒂莫西·哈金斯（Timothy Harkins）说“我们体内的微生物基因组比人类细胞多。我们是一个行走的生态系统。这是一个相当深刻的现实”。

不可培养的大多数

微生物学家早就知道，有许多细菌、真菌、原生动物和病毒在目前的培养技术下无法在实验室中生长。如今，下一代DNA测序技术的价格暴跌和灵敏度飙升，终于让研究人员研究了这一无法培养的多数群体。这一新兴领域的大多数研究包括对环境进行采样，对样本中尽可能多的DNA进行测序，并利用序列信息来识别其中的生物及其可能的生态功能。结果可能令人惊讶。例如，对人体肠道的微生物组学分析显示，每个人的大肠都携带着一种独特的混合细菌，这种肠道生态系统的扰动可能会导致严重的疾病甚至饥饿。尽管DNA测序是微生物组学的支柱，但如果没有仔细的取样和实验设计，即使是最好的测序方案也毫无用处。加州大学戴维斯分校（university of california in Davis）进化与生态学教授乔纳森•艾森（Jonathan Eisen）说“测序是令人兴奋和有趣的，人们经常。。。说‘让我们把所有的东西都测序，然后再分类’”。艾森认为，这种方法掩盖了一些关键问题：“你想要活细胞吗？你也想要死细胞吗？仅仅说‘我要看看DNA’是一个相当粗糙的工具。”除了增加死亡细胞和宿主DNA等混杂因素外，糟糕的取样会破坏研究人员最初想要找到的一些基因组。哈金斯问道：“当[厌氧]细菌暴露在氧气环境中时，它会发生凋亡并自杀，并将其基因组切碎，那么你如何描述这种情况？”一旦他们确定了如何收集有用的样本，调查人员需要确切地决定他们打算问什么问题，以及他们想要如何来确定答案。幸运的是，动物学家和植物学家几十年来一直在研究生态系统的特征。不幸的是，他们还没有达成多少协议。为了对生物进行分类，生物学家可以采取分类学的方法，列出现存物种的清单，并根据它们的特征和它们所占据的生态位对它们进行分类，或者专注于根据进化关系构建系统进化树。这两种方法都有拥护者和批评者。系统发育阵营成员艾森说：“人们对此争论了一百年”。量化生态系统的多样性有点简单。生态学家通常衡量三种多样性：α多样性，基于特定区域内物种或系统发育群的数量；β多样性，比较不同地区之间的多样性；γ多样性，用α和β来说明一个大型生态系统的总生物多样性。在医学微生物组学中，研究人员通常测量单个个体微生物样本中的α多样性，并计算不同人群微生物组之间的β多样性。

覆盖基础

在确定了一个实验设计之后，微生物组学研究人员进入了测序阶段，他们面临着另一个主要选择：是对核糖体RNA（rRNA）进行测序还是对整个基因组的随机片段进行测序。在rRNA测序中，研究人员使用的引物只扩增16S核糖体RNA的基因，这种分子在进化过程中变化非常缓慢。一个样本中不同rRNA序列的数量可以很好地代表物种的数量，这种序列的公共数据库可以用来识别许多生物。相比之下，鸟枪法或宏基因组测序涉及到对样本中所有基因组的短片段、随机片段进行测序，然后再尝试将它们拼凑在一起。每种方法都有优点和缺点。康涅狄格州布兰福德市罗氏公司454生命科学公司的研发负责人托德·阿诺德（Todd Arnold）说：“我认为有些人喜欢鸟枪法，因为总的来说，这种方法更简单，[但是]核糖体RNA方法提供了一种浓缩技术”。核糖体RNA测序对来自人类微生物组的样本特别有用，因为这项技术相对容易忽略宿主DNA的巨大背景，只关注微生物组分。该领域的研究人员也认为rRNA测序是一种更成熟的技术，具有更好的程序定义和更明确的设备选择。然而，宏基因组测序可以在整个基因组中识别出更广泛的变异，并最终使科学家能够在混合样本中对整个基因组进行测序。加州斯坦福大学微生物学和免疫学教授大卫·雷曼（David Relman）说“我认为宏基因组分析的某些方面正在变得越来越常规，越来越现成，[而且]从宏基因组数据中可以学到很多东西”。幸运的是，测序设备制造商并没有表现出固步自封的迹象，有几家公司正在为这两种努力争相提高机器的性能。尽管最近许多微生物组学研究人员已经确定了Illumina的HiSeq系统用于rRNA项目，但Eisen很快指出测序技术仍在迅速变化。“我不认为它已经达到了一个平台，”他补充说，为了宏基因组学研究的基因组测序是特别成熟的新突破。不管他们选择哪种平台，生物学家都可以期望这项技术相对用户友好。阿诺德说：“测序不再被视为那些非常非常擅长测序的人的一项技能，它不再在核心实验室中使用。”。相反，现代高通量测序机是高度自动化的，包括分析原始数据并对其进行初始质量控制检查的软件。随着微生物测序的一些早期应用已经进入了严格管制的医学和药物开发领域，一些齿轮制造商已经将自动化技术向前推进了一步。例如，Applied Biosystems Microseq平台执行传统的Sanger测序，以识别制药设施中的细菌和真菌污染物。该系统简化了测序流程，以快速准确地检测少数特定生物体，而不是在整个微生物群落中寻找所有存在的物种。

沿着数据挖掘

不过，简化的数据和简单的答案与基础研究人员从微生物样品中得到的结果相反。加州圣地亚哥Illumina的微生物高级营销经理Susan Knowles说：“（微生物组）研究涉及深度测序，对于数据存储和数据分析都是数据密集型的”。由于该领域仍处于初级阶段，分析这些数据的软件大多来自研究人员自己。“研究人员在[微生物组学]中使用了一系列开源工具，”Knowles说，并补充说，“这些数据分析工具大多需要一定的生物信息学技能。”对于刚接触高通量测序的科学家来说，测序机发出的大量信息可能会让人震惊。454的阿诺德说，海量的数据往往会让新来者感到困惑。在专注于rRNA的项目中，研究人员可以利用简化的可能序列库和已知rRNA基因的大型数据库。因为这项技术比鸟枪式微生物组测序更成熟，分析rRNA的软件也更容易使用。根据实验者希望找到的信息，他们可能不需要雇佣或成为生物信息学家就可以完成一个简单的rRNA项目。鸟枪式测序是另一回事。“用宏基因组学来做这件事的方法要复杂得多，”艾森说。在一项宏基因组学研究中，科学家们必须从片段序列中识别出假定的基因，确定这些基因属于哪些家族，并试图确定它们来自哪些生物体。每一步都面临独特而严峻的挑战。微生物组学数据分析也提出了一个困扰生物学家几个世纪的问题：到底什么是物种？植物学家和动物学家已经达成了一些初步的定义，但是在细菌中，滥交的基因交换和快速的进化使这个概念变得更加棘手。对于病毒，它可能根本不适用。更糟糕的是，微生物组学本身可能会破坏物种区分的传统观点。如果每个有机体的微生物生态系统驱动着其生物学的关键部分，那么一个个体的结束和下一个个体的开始又在哪里呢？为了避免陷入哲学的泥潭，许多微生物组的研究者已经开始采用操作分类学单位（OTUs）的概念，这是一种实用的、基于基因序列的物种概念的类似物。发散超过一定阈值的序列落入不同的OTUs。由欧洲资助的MetaHIT项目最近使用了另一种方法：根据样本中不同基因家族的假定功能，而不是根据携带这些基因的物种来描述人类肠道微生物组。艾森解释说，“他们是第一批研究β多样性和α功能多样性的人，”就像生物学家对分类群所做的那样。在这个观点中，生物体对生态系统的贡献是重要的，而不是它们的身份或进化起源。在决定如何看待一个生态系统之后，研究人员需要解释数据中固有的偏差。“没有无偏差的方法。真正的挑战和重要的目标是了解数据中的偏差是如何产生的，以及（我们）可以做些什么来最小化或控制它们，”雷尔曼说。例如，将样本暴露在氧气中会消除专性厌氧菌，测序DNA会忽略含有RNA的病毒，温和的提取技术可能无法溶解持久的真菌或细菌孢子。

长时间的

在微生物组学的早期先驱们继续寻找提出科学问题的最佳方法的同时，工程师和设备制造商正在努力解决一些剩余的技术需求。议程上最重要的项目之一是较长的测序读取。“读得越厂越好，”哈金说。他补充说，“300个碱基似乎是一个很好的甜点，300到350个，然后下一个甜点是当你达到600，800个碱基对时。”这些长度允许研究人员以不同的分辨率绘制微生物多样性图，长度越长，物种之间的分离就越细。较长的rRNA序列读取使研究人员能够在系统进化树或分类列表上更清楚地区分生物，而更长的宏基因组读取则更容易组装每个生物体基因组的较大部分。公司也在努力使他们的测序系统更有效地处理多个样本，这对于试图识别人群中微生物群变化的大型临床研究尤其重要。科学家们还试图确定明确的方法和控制措施，以确保可重复的结果。这是个棘手的问题。艾森说：“人们没有测试过很多正在使用的方法，他们只需按一下按钮，就可以运行它们，而我们却在做同样的事情”。高度自动化的测序系统很容易产生结果，但是没有明确的数据分析指南，这些结果意味着什么还不清楚。为了建立一个参考点，艾森和他的同事最近通过混合自然界中从未遇到的已知细菌种类，创造了一个完全人工的微生物组。“我们用不同的方法对它们进行了测序，并测试了我们对一个我们知道答案的系统的了解程度。即使是在那个相对简单的人工系统中，有些部分也非常困难，”他说。经典微生物学可能会有所帮助。雷曼说，新的测序技术，加上正在进行的更详细的细菌环境特征描述的努力，使研究人员能够确定以前不可培养的生物体的培养要求。在实验室里培养这些微生物使研究它们更容易。对微生物组进行更多的探索性调查也应该澄清一些领域的界限，尤其是在医学领域。例如，一个正在进行的研究肺部微生物组的项目已经确定了健康人肺部微生物种群的广泛变化。哈金说：“什么是健康的微生物组？我们还不知道，我们只是触及了表面”。与此同时，微生物组测序和数据分析继续变得越来越简单和便宜，因此即使是本科生和非科学家现在也可以像研究动物一样轻松地研究微型动物。艾森说：“你会惊讶于有多少人刚刚开始用核糖体RNA来做这件事。这和你可能用一副双筒望远镜和一本鸟书做的有点不同，但他们能做到”。

艾伦·多夫（Alan Dove）是马萨诸塞州的科学作家和编辑。