肿瘤由正常细胞自发的或内外环境诱导的遗传学变异所致，具有显著的个体差异和异质性（Heterogeneity）。肿瘤异质性是恶性实体瘤最显著的特征之一。通常认为，肿瘤异质性的表型取决于肿瘤起源细胞（Cell of Origin，尚未发生突变的正常细胞）产生致癌遗传突变的特定组合和次序，以及子细胞相对肿瘤干细胞（Cancer Stem Cell）的分化程度。不同基因型的肿瘤细胞亚群在形态、遗传、代谢、增殖、侵袭转移和药物敏感性等方面存在差异，因此其形成的肿瘤整体具有较高的可塑性。常规的单一治疗方案，容易对肿瘤整体形成一种进化选择压力，在短暂压制了对药物敏感的优势细胞亚群后，对药物不敏感的细胞亚群开始占据生存空间，造成具有耐药性肿瘤的复发和转移，导致治疗失败。肿瘤异质性使得临床患者分型和靶向治疗面临着巨大的挑战，目前没有特别有效的应对策略。因此，需要进一步研究肿瘤异质性发生发展的模式和规律，以期更好地设计和完善肿瘤的整合治疗策略。

肿瘤异质性的进化和抗药性

    常见的肿瘤动物模型通常有三类：移植瘤模型、诱导型模型和转基因模型。移植瘤模型通过将肿瘤细胞系或原代组织移植到免疫缺陷宿主中获得，诱导型模型则可以用致癌物对模式动物进行刺激，引发肿瘤的随机发生。前两类模型的肿瘤在细胞组分上均具有天然的异质性，但是也具有很大的随机性，难以在遗传和细胞谱系上进行细致可重复的深入研究。转基因模型通常通过诱导特定类型细胞中（抑/原）癌基因的变异或异常表达诱导肿瘤发生，具有遗传背景可控的优势。但是均一的转基因设计难以在单一个体中稳定地诱导出携带不同遗传特征的细胞亚群，无法模拟真实肿瘤患者体内复杂的局灶性病变。

    近日，复旦大学王旭课题组在学术期刊Journal of Molecular Cell Biology（JMCB）在线发表了题为“Transgenic Strategies to Generate Heterogeneous Hepatic Cancer Models in Zebrafish”的研究成果：提出三种不同的策略来构建异质性的转基因斑马鱼肝癌模型，以更好地模拟肝癌异质性的起源及进化。

    斑马鱼作为一种微小型脊椎模式动物，具有与哺乳动物极为保守的遗传和细胞行为特征，是发育生物学领域重要的研究工具。斑马鱼适合高效的转基因构建，其幼体器官尺寸小，具有光学透明性，因此能够在细胞分辨率下对胚胎发育过程进行体内实时的细胞谱系示踪和高通量药物筛选，而这些优势均可以在肿瘤生物学的研究中得到应用【1-3】。

    在本文中，作者首先将hsp70l:ABC-2A-tcf7l2质粒注射入Tg(fabp10a:tetOn; tre:eGFP-krasv12; tcfsiam:mCherry)转基因斑马鱼的单细胞受精卵中。Tg(fabp10a:tetOn; tre:eGFP-krasv12; tcfsiam:mCherry)是一种稳定的转基因肝癌模型，其所有的肝脏细胞均会表达致癌的eGFP-krasv12融合绿色荧光蛋白，而注射的质粒则会在早期胚胎快速分裂细胞的细胞质中不均一分布。采用热激启动子hsp70l的设计诱导人源 β-catenin（ABC）和斑马鱼Tcf7l2蛋白的异质性表达，使其结合于经典Wnt信号通路的报告转基因tcfsiam:mCherry的启动子上，诱导红色荧光蛋白mCherry在肝脏中的异质性嵌合表达。

    其次，作者利用UAS启动子的随机沉默可以产生基因嵌合表达的现象，构建了可以稳定发生异质性模式的转基因斑马鱼Tg(fabp10a:tetOn; tre:Gal4; UAS：ABC-2A-tcf7l2)。该转基因斑马鱼在Dox的诱导下，同样诱导人源 β-catenin（ABC）和斑马鱼 Tcf7l2蛋白的异质性表达，使其结合于经典Wnt信号通路的报告转基因tcfsiam:egfp的启动子上，诱导绿色荧光蛋白eGFP在肝脏中的异质性嵌合表达。

    最后，受到神经发育生物学的示踪工具脑细胞彩虹“Brainbow”转基因技术的启发【4】，作者将癌基因krasv12和Myc分别与不同的荧光蛋白融合，按照“Brainbow”的结构重新整合，获得新的转基因元件癌细胞彩虹“Oncobow”。Tg(fabp10a:tetOn；tre:gal4；UAS:Oncobow)斑马鱼的肝细胞中异质性地表达不同的癌基因及其组合。通过对应的荧光蛋白信号开展活体动态观察，可以初步揭示转基因肝癌模型中不同细胞亚群的起源和进化过程。

    以“Oncobow”为代表的异质性转基因肝癌模型相比常规的转基因模型更为贴近真实世界中的患者肿瘤，其对药物的反应也更为复杂。进一步运用这些异质性转基因斑马鱼肝癌模型开展药物组合处理和实时的系统评估，有助于我们更好地理解肝癌细胞异质性的动态行为和变化规律，以期为高异质性肝癌患者开发新的干预方案提供依据。

构建异质性的转基因斑马鱼肝癌模型策略III: 癌细胞彩虹“Oncobow” 

通讯作者

王旭，本科毕业于中国科学技术大学，在美国University of Utah获得博士学位， 在University of California, Irvine进行博士后训练，现任复旦大学代谢分子医学教育部重点实验室青年研究员，复旦大学肿瘤研究所肿瘤代谢实验室副研究员。王旭博士以模式生物斑马鱼和小鼠为主要研究工具，在发育和肿瘤生物学领域做出多项原创性的贡献，其中以第一或通讯作者在Developmental Cell、Cancer Research等领域专业杂志中发表SCI论文11篇。2018年获中国动物学会卡尔蔡司/斑马鱼优秀青年学者奖。近年来主要主要研究方向为肿瘤发育和代谢生物学，利用模式生物斑马鱼在个体大小和透明等方面的优势，拓展其在肝癌和胰腺癌演化机制研究中的新应用，并以斑马鱼肿瘤模型为主要工具开展药物筛选、基因治疗和合成细胞治疗方案的探索。

复旦大学基础医学院博士生费飞（左一）为该论文的第一作者

参考文献：

1. Yao Y, et al. (2018) Canonical Wnt Signaling Remodels Lipid Metabolism in Zebrafish Hepatocytes following Ras Oncogenic Insult. Cancer research 78(19):5548-5560.

2. Yao Y, et al. (2017) Screening in larval zebrafish reveals tissue-specific distribution of fifteen fluorescent compounds. Disease models & mechanisms 10(9):1155-1164.

3. Wang J, et al. (2018) Csy4-based vector system enables conditional chimeric gene editing in zebrafish without interrupting embryogenesis. Journal of molecular cell biology 10(6):586-588.

4. Cai, D., Cohen, K.B., Luo, T., et al. (2013). Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat. Methods 10: 540-547.

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