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焦磷酸测序技术-Pyrosequencing

已有 4619 次阅读 2010-9-27 10:12 |个人分类:基础知识|系统分类:科普集锦

        焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是新一代DNA序列分析技术,该技术无须进行电泳,DNA片段也无须荧光标记,操作简便。Pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应,在每一轮测序中,只加入一种dNTP,若该dNTP与模板配对,聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号,并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP,继续DNA链的合成。
        瑞典AB公司基于Pyrosequencing技术而研究开发的PSQ 96系统是一个理想的遗传分析技术平台,它既可进行DNA序列分析,又可进行基于序列分析的SNP检测及等位基因频率测定。具有以下优点:不需要制胶,不需要毛细管,也不需要荧光染料和同位素;10分钟内可分析96个样品的SNP,可满足高通量分析的要求;每个样品孔都可进行独立的测序或SNP分析,实验设计灵活;序列分析简单,结果准确可靠。
         Pyrosequencing技术的原理:
         Pyrosequencing是一项全新的DNA测序技术,可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本原理如下:
         第1步:1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合,然后加入酶混合物(包括DNA PolymeraseATP SulfurylaseLuciferaseApyrase)和底物混合物(包括APSLuciferin) 
         第2步:向反应体系中加入1dNTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对,则会在DNA 聚合酶的作用下,添加到测序引物的3’末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。第3步:在ATP硫酸化酶的作用下,生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素酶的催化下,生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素,同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰,峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
          第4步:反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATPApyrase的作用下降解。
          第5步:加入另一种dNTP,使第24步反应重复进行,根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。
          Pyrosequecing技术操作简单,结果准确可靠,可应用于SNP位点检测、等位基因频率测定、细菌和病毒分型等领域。


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1 杨华磊

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