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用于结晶的膜蛋白纯化

已有 1413 次阅读 2018-7-4 13:56 |个人分类:读后感|系统分类:论文交流| 膜蛋白纯化, 去垢剂

 

用于结晶的膜蛋白纯化

 

本文为阅读“ Kim J, Ng H L. Screening and Identifying Membrane Proteins Favorable for Crystallization[M]// Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons, Inc. 2017:1708.的读后感。作者:陈埔

 

    膜蛋白在细胞总蛋白中所占比例极高,但是在已经解析的所有蛋白结构中,膜蛋白所占的比例却比较低。这是因为目前融合蛋白表达手段有限,导致膜蛋白表达量较低,而且蛋白的错误折叠和聚集也成为膜蛋白表达中的重大难题。在纯化过程中,膜蛋白更容易变性、沉淀,使得膜蛋白的纯化较难。如何获得大量的膜蛋白进行结晶,或者获得质量较高的膜蛋白进行冷冻电镜研究成为了最大的瓶颈问题。

过去的二十年里,大量的膜蛋白获得了高分辨率的晶体和电镜结构,这大部分归因于去垢剂的正确应用,这使得膜蛋白的纯化和结晶成为可能。去垢剂成为了膜蛋白纯化的应用最广范的手段。



    这篇文章总结了目前使用较为广范的去垢剂使用原则和方法,提供了一份较好的protocol:

1. 离心,收集细胞;

2. 裂解buffer进行细胞裂解;

3. 裂解后,4000g或10000g,4℃离心15min;

4. 根据上清的体积,加入去垢剂至合适的浓度;

或者可以在第3步之后,48000g离心1h收集膜片,然后加入含有一定浓度的去垢剂的buffer,进行重悬

5. 室温搅拌3-4h;

6. 48000g离心1h;

7. 上清用于Ni-NTA纯化,(可使用AKTA进行浓度洗脱)洗脱过程中的buffer需要含有去垢剂浓度至少是2*CMC

8. 纯化得到的蛋白可用于下一步的晶体生长。

通过此方法,我们可以得到一些适合利用去垢剂纯化的蛋白,从而进行结晶和生化实验。

 

参考文献

[1] Kim J, Ng H L. Screening and Identifying Membrane Proteins Favorable for Crystallization[M]// Current Protocols in Protein Science. John Wiley & Sons, Inc. 2017:1708.




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