Base Excision Repair (II)

DNA真的希望自己突变吗？Well, that depends…

本身仅仅是一个分子而已，何来希望呢？在愚人节那天有篇帖子描述了“水”是如何主宰世界的，其实DNA也有类似的作用。为何在细胞的环境中DNA可以吸引那么多的蛋白有序过来完成她自身的复制？突变，有利有弊：正常情况下DNA是希望安然的生活，异常状况发生后也不得不改变自己（与其说自愿，不如说被迫）。简单来说，DNA的损伤主要来自内源和外源因素，比如自身氧自由基的氧化、复制时引入的错误，再如高能量刺激、致癌因素、病毒感染等情况。引发的损伤也包括多种情况，如碱基的氧化、羟化和水解，核苷酸的错配等，我想Chemists会很好的阐述DNA有哪些变化的可能，根本还是化学键的变化。下面再简单看看BER过程中的酶有哪些关键的作用（主要参考Rachel J. Carter andJason L. Parsons, Mol. Cell. Biol. May 201636:1426-1437）。

PTMs（Posttranslational modification）

转录后修饰之所以越来越活跃，也是得益于基础研究对该领域多年的坚持。大概五年前在实验室接触磷酸化（phosphorylation）、乙酰化（acetylation）、甲基化（methylation）、泛素化（ubiquitylation）和SUMO化（SUMOylation），当时并没有仔细思考每一种修饰背后的故事，只是略微知道这些“化”有着某种调控机制，因为我们专注于病毒的转录调控和细胞的信号通路。现在看来，这些基本存在的调节有着广泛的作用，比如影响蛋白的功能、改变酶的活性、细胞定位、蛋白间的相互作用、表达水平等，其实这只是表观遗传学中的小部分，是PTMs中常见的方式，如今人们发现这些修士可以作为医药研发中的特异靶点，因为看似普遍的机制后面有着特异的效果。近年来发现BER中的关键酶就是受这些PMTs的调节，发挥DNA修复的功能（修饰能影响功能，这与战国时期的“术”的概念好像，与如今的心理作用好像，与为人处世也很像，所要改变的是方式）。

DNA glycosylases

UNG（uracil DNA glycosylase），尿嘧啶DNA糖苷酶，主要与尿嘧啶及其衍生物的的修复有关。UNG1主要分布在线粒体，UNG2主要在细胞核中。UNG2在细胞周期的S期中常被Cdk（cyclin-dependent kinase）磷酸化，不同位置的磷酸化会影响其功能（追求精确氨基酸位置的朋友可阅读原文），其中的两个位置（T6和T126）被磷酸化以后会提升UNG2在体外的DNA glycosylase活性，而p53诱导的PPM1D/Wip1去除T6的磷酸后可降低此活性。此外，在HepG2细胞中有人发现UNG2可被SUMO化，减缓其泛素化后引发的蛋白降解（只是目前人们对泛素化调节UNG2降解的过程并非清楚）。

SMUG1（Single-strand-selective monofunctional uracil glycosylase 1），还是缩写的名字好记，正如其名，这个酶也可以修复尿嘧啶相关的DNA损伤，尤其是U-G错配，主要是在非复制的DNA区域，C中的氨基被脱掉。人们在体内发现SMUG1可通过Cul1或Cul4泛素连接酶介导的泛素化通路降解。HIV中的Vpr可以通过Cul4A-DDB1降解UNG2和SMUG1。

TDG（Thymine DNA glycosylase）可被CBP/P300乙酰化（还记得CR师兄的工作就是围绕这种修饰），之后抑制对APE1的招募，进而抑制了DNA修复的过程，有趣的是在乙酰化位点旁边会发生磷酸化，可能会补偿DNA修复的效应（这个就和我当年的一部分工作很相关了，我一直在寻找D变成N为何会明显提升反式转录激活蛋白的活性，或许真的和糖基化、乙酰化和磷酸化有关，只是没有选好实验方法）。人们TDG最清楚的应算SUMO化，在K330的位置被SUMO1修饰。在体外SUMO-1会降低TDG和DNA间的结合作用，使之从AP位点解离。K341影响蛋白与CBP的作用，一直乙酰化，可能减弱与APE1的相互作用。近期也有研究显示她和泛素系统有关联，只是泛素化位点还不确定。

还有其他的酶如MBD4（methyl CpG binding domain protein 4）在体内、外可被PKC（protein kinase C）磷酸化后提高对甲基化的CpG寡聚核苷酸的切割活性，也就显示在激素诱导的DNA去甲基化和转录抑制中由MBD4介导的BER会发挥一定的作用；MYH（MutY glycosylase homologue）可以切除A-G或A-8oxoG配对中的Adenine，通过磷酸化调节酶的活性；OGG1（8-oxoG DNA glycosylase）是主要修复8-oxoG和FapyG类的DNA损伤的酶，是p300的底物，也有人研究他的泛素化和磷酸化；MPG（Methylpurine DNA glycosylase）主要修复羟基化的碱基，在体外受P300调节，体内的磷酸化也对其活性有影响；还有NTH1（Endonuclease III homologue）主要修复被氧化的嘧啶，EIL1 to -3（The three glycosylasesendonuclease VIII-like protein 1 to -3），未见与PMTs有关的报道。

End Processors

PARP-1，poly(ADP-ribose) polymerase 1，是一个很眼熟的名字，Yahoo一下发现这也是一个热门的靶点，AstraZeneca去年年底的一个商品Lynparza（Olaparib）完成了PhII临床试验，用于治疗经标准疗法治疗但无效的晚期前列腺癌男性患者，百济神州和Merck联手也在开发PARP抑制剂，也有文章报道PARP抑制剂有望用于治疗白血病，还有人用PARP抑制剂于PD-1抗体Keytruda联用，效果明显（美中药源报道“PD-1抑制剂Keytruda对错配修复缺陷的人群应答率好）。PARP抑制剂可以抑制BER和SSB（strand break repair）的修复，尤其是对BRCA1缺陷的乳腺癌细胞有明显的抑制作用，这也是吸引人们关注PARP调节的重要原因。PARP受多种PTMs的调节，体内外受P300的乙酰化、ERK1/2的磷酸化的调节，SUMO化和泛素化对其功能也有影响，其中泛素化的报道相对多一些，人们发现多种E3连接酶会介导PARP的泛素化，比如RNF4、Iduna/RNF146、CHFR等蛋白。

APE1（Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1）是E.C.Friedberg在1966-1968年间从事博士后研究时“unwittingly”发现的，当时他主要关注的是影响DNA的遗传重组的内切酶，并非修复DNA的内切酶。当时他的导师David Goldthwait（Western Reserve university）希望他通过烷基化改变DNA的构象（作者自称当时too naïve，和导师争论这种方法不可行），在寻找一种内切酶能够攻击此处，诱发重组。结果作者尝试了许多办法，利用同位素标记的DNA被分离后并没有发生重组的现象，不过偶然发现了一种酶确实可以切除烷基化的DNA（首次发现，这种酶被命名为endonuclease II，因为人们从E. coli中发现了endonuclease I）。后来的实验证明这个酶可以特异的识别烷基化的碱基并将其切除，也就是第一个AP E1。现在人们发现乙酰化、磷酸化、泛素化多种PMTs，并且发现了相应的修饰位点，并且多种修饰间存在crosstalk，这就丰富了研究的内容，就会有许多新发现接连出现，谁让这是分子生物学，一旦提到分子水平，就复杂的多，这时真的需要哲学的思维来理清思路。

还有PNKP（Polynucleotide kinase phosphatase）对DNA的活性分为5’激酶和3’磷酸酶两部分，所以比较适合修复SSB，当然也包括BER。人们发现此酶可被ATM和DNA依赖的蛋白激酶（DNA-PK）磷酸化，尤其是在氧化压力下。磷酸化的水平会抑制该蛋白的泛素化过程；FEN-1（Flap endonuclease-1）在Long-patch BER中比较关键，是DNA结构特异的内切酶。

DNA polymerases

提到DNA聚合酶，首相看到的是聚合DNA的过程，再就是PCR中的Taq Pol，要不是近期需要搭建DNA pol的试验方法，我还是不会关注DNA pol的消息。其实DNA pol的家族也是比较庞大的，不论是原核生物还是真核生物，如今已经发现了多种pol，配合不同，功能各异。想想看，DNA聚合需要的基本功能包括聚合酶和外切酶的活性，因为核苷酸沿着模板从因为开始延伸，遇到障碍必然要切除，这可以让DNA完成聚合，当然也有潜能完成修复，只是切除和聚合颠倒顺序的问题。Pol β是作用在BER中主要的DNA pol，受多种PTMs的调节，他的活性高低所引发的就是BER的swift，之后发挥作用的就是Polδ/ε。最后连接骨架的工作交给了DNA ligases（如Lig IIIα和Lig I），同样是倍受PTMs影响的的过程

看到PTMs的广泛调控，我很想知道该如何系统的研究这一调控？发现一个底物，有没有一种直接的分析、模拟可以先预测一下PTM的影响？虽说诸多中修饰对蛋白的功能有影响，如何发现一种关键的调节点，能够用于药物的研发？目前人们从BIG DATA中发现一些未曾被人们仔细研究的信息，蛋白质组学的数据显示有更多的PTMs发生在BER的调节酶上，只是需要更多的实验和时间去揭示其中的机制。深入研究Crosstalk也是很好的方向，绘制出更清晰的网络结构，这样能综合分析PTM对底物的影响。综述文章在最后提到一点在线粒体中一样存在BER现象，有专门的先关蛋白，也是很有趣的地方。

有错误，及时纠正，才不至于酿成无法弥补的后果。DNA的修复机制有很多，可是也抵不过时间的摧残，细胞老化的时候还是一样会发生各种各样的损伤、错误，或许是DNA造就了细胞中的许多酶，也可能是这些酶维持了DNA的稳定性。看着分子间的相互作用，有时真的觉得那就是人类的微型小社会，让人汗颜。

Time for English club…

TJ Pharmaron

2016年5月4日星期三