Base Excision Repair (I)

偶然又看到一篇文章介绍DNA修复，该文章的描述看起来与CRISPR没有多少关系，却与PTMs（protein posttranslational modifications）密切相关。近期听说关于PTM的报告、靶点、药物比较多，不妨浏览一下这篇Mini Review（Rachel J. Carter and Jason L. Parsons, Mol. Cell. Biol. May 201636:1426-1437），看个究竟：DNA是如何“智能”修复的？有哪些方式？是否涉及一些热门的医疗靶点？人们是如何一步步揭示这个快速且普遍的过程？目前应用如何？有哪些难处？国内外的研究进展怎样？有人建议我听报告和做实验的时候要有批判和怀疑的眼光，反面审视他人或自己的方案是否合适，是否最佳？这样更容易理解别人是如何开展工作的、预测可能的结果及解决方案，还可以反复琢磨自己的设计是否合理。

DNA的复制其实是一连串的“工程”，只是执行此项任务的不是人类，而是人类内部所谓的分子们。细胞需要存活、增殖，DNA的复制也是一切的起始步骤，为了能让她顺利地Copy，细胞需要充足的准备，保证足量的原料（A、T、G、C）、工具（酶和辅助因子等）、合适的时机（Check Point）等，虽说绝大部分的工作是100%精确完成，可是细胞的群体太多，DNA这条长链上的碱基数目庞大，人类细胞平均每天产生的错误/损害>10,000bp。这种复制性障碍需要及时的修复，否则后果相当严重，这种错误也会随之复制而增多，直到后来不可收拾，诱发各种疾病（其中最普遍的就是Cancer）。DNA的损伤可以来自UV的照射、放射性辐射（ionizing radiation, IR）、致癌物质等外因，其实DNA本身的遗传稳定性也不高（只是平时的实验过程比RNA要豪放的多，才让我感觉DNA有较高的柔韧度），比如水解反应、细胞氧化代谢过程、其他环境因子也会影响DNA的稳定。

虽说有如此多的不确定因素，可是表观（真正的表面上看，非学科）上看人和细胞并没有太多的变化，并非像细菌那样会产生抗性、诱发缺陷，这里面和多因子遗传先关，也一定和DNA的修复相关！去年的Nobel Prizes中有“Mechanistic studies of DNA repair”就证明了过去十多年的时间人们对DNA修复机制的认可和关注。

DNA碱基损伤包括碱基缺失（apurinic/apyrimidinia [AP] sites）、DNA碱基修饰（碱基羟化和氧化）和主要的DNA单链断裂（DNA single-strain breaks, SSBs）。早在1970s时期，Tomas Lindahl首先发现DNA的N-糖基化酶，也就是尿嘧啶-N- 糖基化酶（Uracil DNA N-glycosylase, UNG），可以直接中DNA中切除尿嘧啶。之后他还发现DNA内切酶、聚合酶（Polymerase, Pol）和连接酶（Ligase, Lig）会完成后面的“切除-修复”过程，也就是现在人们说的BER（baseexcision repair）。

Repair of DNA base lesions by the human BER pathway

BER是一个精密调节的过程，由DNA损伤特异的糖基化酶诱起始。感觉这个过程又奇怪又神奇：针对不同的DNA损伤，有不同的酶来修复。试问：哪种情况被认为是损伤？他们是如何高效的完成修复呢？为何人类的部门之间没有这种默契和方式？下面简单介绍一下这个过程。

细胞内的DNA glycosylase主要分两种：单功能（仅仅有DNA glycosylase的活性）和多功能（DNA glycosylase和DNA链剪切活性）；修复的方式主要有两种：short-patch BER和long-patch BER（顾名思义，小补丁和大补丁）。发生损伤的（不正常的）核苷酸的被DNA glycosylase识别并切断碱基和磷酸二酯键间的N-糖苷键，生成AP位点，之后被AP内切酶1（AP endonuclease 1, APE1）识别并切断DNA的一条链，产生缺失一个碱基的缺口，3'端是羟基，5'端是脱氧核糖磷酸（5'deoxyribosephosphate,5'dRP）。每次谈到化学我就显得无力了，可以参考下图观看细节。根据键不同的断裂位置，3'端也存在磷酸的情况，主要依靠PNKP（polynucleotide kinase phosphatase）的激酶活性，这两种方式被称为APE-1依赖的通路和APE-1非依赖（PNKP依赖）的通路。3'端是羟基的缺口是DNA聚合酶（Polymerase,Pol）的底物（主要是DNA Pol β），该缺口处的5'dRP被切除后再加入正确的、“健康的”核苷酸，接着被一个含有DNA ligase III α（Lig III）和XRCC1（X-ray cross-complementing protein 1）的复合体缝合痕迹（Nick）。这种修复是通过切除错误的核苷酸，再插入正确的核苷酸，这种方式即为short-patchBER，占修复事件的80%左右。这也就以为着存在意外，有些错误不能通过此种方式，比如5'dRP被氧化、抑制Pol β的活性，这个时候发生作用的DNA Pol是δ或ε（δ/ε），他们会在缺口处加入若干个核苷酸（通常2~8 nt），产生5'-flap结构，接着被FEN-1（flap endonuclease-1）这种依赖PCNA（proliferating cell nuclear antigen）的内切酶切掉flap，最后由Lig I/PCNA修复此处痕迹。这种方式就是所谓的Long-patch BER。

APE1-mechanism（By Roland Mattern）

这篇综述后面详细的介绍了BER过程中的关键酶，我想放到下一部分介绍。看到这里我心中有个疑问：为何是Base ER，不是Nucleotide ER？切除碱基和切除整个核苷酸有何区别？二者有哪些地方不一样？BER在发现的早期是什么样的状态？人们又是如何发现的？我好像总是对如何发现的感兴趣，因为这里面有很多tricky的事情，许多人都能看到的事实，只有极少数人能够从中猜测背后的真理。随便搜了一搜，看到一篇前不久发表的文章“A history of the DNA repair and mutagenesis field: The discovery ofbase excision repair”（Errol C. Friedberg, DNA Repair 37,2016, A35–A39），好像正好能解决我的问题，毫不犹豫地我就让公司的同事Kun帮我下载了。

原来是这样：BER确实不同于NBR（nucleotideexcision repair）！

这篇文章的作者Errol和Tomas是多年的朋友，自1971年二人相识，便开始了长期的友谊，围绕着多种DNA的修复方式讨论、合作（也包括厨艺、红酒，后来Tomas获得终身教授职位时，同时也是瑞典食物与红酒杂志的品酒师）。Tomas在1960年代中期毕业后再JacquesFresco博士的实验室开展博士后的工作，关于tRNA的结构和构象。然而经常tRNA经常发生分解，给他的实验带来许多困扰，由其是在高温的条件下。后来他意识这是tRNA的化学不稳定性所决定的，一些键容易发生断裂。这个现象给了他提示：DNA这种更大的分子中一定也存在化学不稳定性，他计划寻找能修复此种断裂的酶。后来Tomas回到了Karolinska Institute做助理教授，开始研究DNA内部化学键的水解与温度和pH的关系，后来他发现生理条件下DNA自然发生的水解现象的比率在生物学水平上算是明显的（1993, Nature, 362:709-15）。

在RNA中核糖的2'-OH是发生水解的弱点，Tomas推测在DNA的脱氧核糖中应该是N-糖苷键。他还推测E. coli在37oC条件下40min可复制一代，每两代会丢失一个嘌呤，而哺乳动物细胞中的DNA大概是E. coli的800倍，大概20h复制一代，每代可能丢失12,000个嘌呤。假设这些所有丢失嘌呤的位点都被修复，那么细胞中修复DNA的能力是相当惊人的。化学上看DNA更容易在氨基处发生水解，也就是Cytosine和她的类似物5'me-Cytosine，相应的会水解成Uracil和Thymine。知道了会发生那种变化也就掌握了重点问题，下面如何筛选能移除Uracil的酶就显得不是那么困难了。1974年他发现了N-glycosylase（T. Lindahl, PNAS, 1974, 3649-53）这里充满了运气，不得不承认他选择了一个看起来笨拙但极为有效的分离方法（可参考E.C. Friedberg, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997, pp.121–122）。

Hydrolysis of cytosine to uracil

这样重大的发现过程往往不是一个人或一个团队所能完成的，而是有了许多更为关键、指引性的结果在眼前，其实重大突破更多的是某个课题组优先发现，与此同时可能有若干个团队也几乎要解释其中道理，只是这种热门的发现只有第一，没有第二。若不是Tomas，也会有A或者B在那个时间段揭示N-glycosylase的存在（所以有的时候我觉得人类的文明是可以推测会预算的，只要把人类看成一个整体，也就不难推算类似三体星际的文明程度）。Tomas后来细化了实验，分析了Uracil是如何移除的，他发现因水解离开DNA的是碱基，不是（部分）核苷酸，也因此人们称之为BER，与NER以示区分。发现了一个酶，就会有一批人被吸引过来，继续寻找与之类似的其他酶。研究就是这样，反正有人盯着，如果有机会，分一杯羹也是不错的。

新的问题就来了，如果你处在当时的年代，会如何开展下一步的研究？是利用一样活大同小异的方法筛选新的酶？还是延续研究修复后的若干种方式？还是回过头来探索这种酶是如何作用在错误的DNA上？还是想知道一些这一过程中可能被隐藏的事件？静下心来想一想，我觉得是比较难的，一个是我不了解当时的研究进展，二也是我不清楚这片领域。不过我很想知道这个酶是怎样识别又是如何行使功能，后面修复还需要什么等等，其实这里有着先入为主的概念，因为我已经知道了DNA修复的上下文。

其实还有其他的许多发现，在让人们对DNA的修复有了如今较为细致的了解，比如AP位点相关水解酶、DNA骨架连接酶、正确碱基的插入等等，了解每一步细节就是科学的使命，虽说一些过程现在看来并非关键，但是能阐述任何一个疑问，就是科学前进的动力。下次再详细介绍一些BER内部先关酶的作用和机理，在结尾想引用两位名人当时对DNA修复的部分对话：

“Discovery, examined closely seemed, curiously difficult to pin to a moment or to an insight, or even a single person”

-By Horace Judson, 《创世纪的第八天》作者

“I think that’s the nature ofdiscoveries, many times: that the reason they’re difficult to make is thatyou’ve got to take a series of steps, three or four steps, which if you don’t make them you won’t get there, and if you go wrong in any one of them you won’t get there.”

-By Francis Crick

Good night…

TJ泰河园

2016年5月3日星期二