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背景1：Biotin属于B族维生素，又称维生素H，维生素B7等。

背景2：“suicide enzyme”也称“single turnover enzyme”，是指在酶作为共同底物参与反应，并且在反应结束后失去催化活性。目前发现的suicide enzyme有三个：1 本文中报道的来自蓝细菌BioU，参与biothin合成；2 Saccharomyces cerevisiae来源的THI4p，参与另一个B族维生素Thiamine pyrophosphate 1中噻唑基团的合成（Nature. 2011,478(7370):542-6. doi:10.1038/nature10503）；3 大肠杆菌来源的Ada ，参与DNA修复（Cell，1986, 45, 315–324. J. Biol. Chem. 1988,263, 4430–4433. Proc.Natl Acad. Sci. USA ,1985,82, 2688–2692）。

通常情况下，Biotin 的生合成途径在所有生物中都是相似的，即：1. 庚二酰辅酶A或者庚二酰ACP的合成；2. 庚二酰中间体在BioF，BioA，BioD和BioB四个酶的作用下合成biotin。

本文作者在研究biotin生合成基因簇时发现Synechocystissp. PCC 6803 和 Cyanothecesp. PCC 7424基因组中缺少了bioA，并且bioF，bioD 以及bioB 并不像其他微生物的基因簇都是成簇存在，而是都分散在基因组中。通过生物信息分析，在这两株菌中分别发现了可能代替bioA 作用的基因，slr0355（bioU） 和PCC7424_0836。通过基因敲除以及基因回填实验确定了这两个基因确实能够参与biotin的生合成，可能与AON（3，8-amino-7-oxononanoate）向DAN（4，7,8-diaminononanoate）的转化有关（Figure 1.）。

Figure 1. a Synechocystis sp. PCC 6803-Δslr0355::Kmr growth on a BG-11 plate b and on a BG-11plate supplemented with 1μM biotin .

3到4的转变需要NADH和氨基供体，但是作者在体外反应时，BioU确实使 3减少，但是反应不需要任何氨基供体，而且检测不到4。作者猜测BioU作为氨基供体参与了反应，从而生成的化合物与酶形成了结合物，因此检测不到4。采用LC-HR-MS分析体外反应体系，以及天冬氨酸N端酶水解后的反应体系，发现在反应后的121-137位中间氨基酸片段比反应前的分子离子峰多了171。对124位赖氨酸进行突变，反应不能进行，从而确定DAN与124位赖氨酸结合（Figure 2）。

在已知的biotin合成途径中，DAN从络合物中释放，进而作为BioD的底物，产生6。在BioU与3的反应体系中，没有检测到4。作者发现，EcBioD（大肠杆菌来源BioD）能够在NADP+存在的情况下催化BioU-DAN产生6。但是在反应过程中依然不能检测到4的存在。BioD催化4产生6需要两步反应。通过以上实验结果作者猜想，BioU-DAN结合物被羧酸化产生BioU-DAN氨基甲酸的结合物，之后DAN氨基甲酸被释放，进而作为BioD的底物参与反应（Figure 3a）。在反应过程中4以BioU-DAN的形式存在，因为不能检测到4。将BioU在ΔbioD 的大肠杆菌中表达，不能得到6。这是因为BioU只能产生5，只有部分BioD的作用。但是5不稳定，因此不能检测到（Figure 3b）。BioU和EcBioD能够产生6，但是在这个反应过程中，不需要氨基供体的参与。这与已知的反应有悖。作者猜想，BioU在反应中作为氨基供体，Lys124中的氨基在反应中转移到5上。为了验证假设，将反应前后的BioU用天冬氨酸激酶进行降解之后，MS和MS/MS分析第121-137（¹²¹DALKRTSAVEQLITLRE¹³⁷）氨基酸片段。实验结果证明，Lys124在反应后转变为半缩醛（Figure 3c）。而且发现反应结束后，BioU失去催化活性。

Fig. 3 | Proposedreaction of BioU via the BioU-DAN conjugate. a, Reactions of BioA andBioD in typical biotin biosynthesis. b, Proposed reactions of BioU andBioD in biotin biosynthesis in Synechocystis sp. PCC 6803. BioU-SA indicates BioU-Lys124 semialdehyde. c, LC-HR-MS analysis of the target peptide of BioU by Asp-Ndigestion before and after the reaction.

为了进一步证明BioU的反应机制，作者得到了BioU的蛋白晶体。分析发现BioU具有两个domain（Figure 4a）。Domain I是核酸结合区域，domain II是底物结合区域。通过定点突变后的蛋白晶体确认，3与Lys124连接（Figure 4b）。BioU中保守序列¹⁵GFGGLG⁹中Arg189-Ala190以及Thr191侧链的氮原子能够识别NADP+的磷酸基团（4c）。在3与BioU形成络合物的过程中脱去的一分子水与His198的氮端和Lys124的碳端结合（4b）。BioU-DAN的络合物共晶也揭示了Lys124与NAD+的结合方式（4d）。通过BioU与7的共晶发现，9位羰基与His233的氮端结合，His233的氮端与Asp235结合。从而确定，His233和Asp235是BioU催化BioU-DAN中7位羧酸化的活性位点（4e）。作者将BioU中His233和Asp235进行突变，与EcBio反应，发现6的产量减少，而非完全消失。而且突变后的酶仍然能够形成BioU-DAN络合物。以上实验结果说明His233和Asp235与络合物的生成无关，是羧酸化的反应位点。羧酸化后DAN通过NAD（P）⁺氧化从BioU中释放。至此，本文完全确定BioU能够参与biotin合成中的三步反应以及其反应位点以及机制（Figure 5）。

Fig. 5 | Proposed reaction mechanism of BioU.

作者在研究biotin生合成基因簇时发现Synechocystis sp. PCC 6803在基因组中少了BioA的情况下仍然能够产生biotin。研究人员通过生物信息分析及一系列实验，最终确定了BioU的功能：先形成BioU-DAN络合物，再生成DAN氨基甲酸，以及释放DAN氨基甲酸。BioU在反应结束后失活，符合“suicide enzyme”特征。这是目前发现的第三个suicide enzyme。