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遇见生物合成|高毒性苯甲内酰胺类化合物necroximes的发现、生物合成及基因挖掘-探索蜘蛛传真菌中共生细菌

已有 578 次阅读 2020-2-24 19:52 |个人分类:生合途径解析|系统分类:论文交流| 苯甲内酯, 生物合成, 基因挖掘, 蜘蛛传真菌, 共生细菌

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遇见/摘要

本文从蜘蛛咬伤形成的坏死组织中分离出一株真菌( Rhizopus microsporus ),该菌中含有的共生细菌Burkholderia sp. )可产生高细胞毒性化合物necroximes,此类化合物结构含有苯甲内酯、肟取代的酰胺以及酯化短肽侧链。作者基于基因测序、生信分析、以及基因敲除等手段,确认necroximesPKS/NRPS负责合成,这为此类化合物的生物合成研究提供基因组挖掘依据,也为人类疾病中基于假设的药物发现提供了范例。


叨叨1本号曾报道植物内生真菌产高毒性次级代谢产物的文章(详见往期推荐3),这种高毒性的产物会在药用领域发挥重要作用。本文也证明高毒性次级代谢产物的产生来自共生细菌,而不是宿主真菌,这为很多真菌代谢产物的溯源提供一个案例。

叨叨2:本文利用特异性PKS末端DH结构域进行基因挖掘,给很多新型发掘提供了理论支撑。本文层层深入,从天然产物发现到生物合成探究,再到基因挖掘,是一整套的研究流程。

叨叨3刚看到这个文章的时候就想过把这个真菌共生系统加载到他的蜘蛛丝上,是不是杀伤力更强。又不致死,符合蜘蛛侠未曾杀过人的超级人设。


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遇见/内容

1980年代后期,一名澳大利亚妇女在她的花园中与一蜘蛛短暂相遇,后者在她的小手指刺了一下,强毒性造成右手的肘部以下被截肢。有人从坏死的深部组织样品培养出一种真菌Rhizopus microsporus var. microsporus CBS 308.87。常见文献报道昆虫和蜘蛛可作为此类真菌植入皮下组织的载体。有趣的是,蜘蛛咬伤传播的真菌菌株中也含有共生细菌。[7]其中细菌内共生菌(Burkholderia sp. HKI-0404, isolate B8; Figure 1A)处在根霉菌-伯克霍尔德氏菌共生系统(Rhizopus-Burkholderia symbiosis)中独立的进化枝,除了产生抗有丝分裂的根瘤菌素(rhizoxin)类混合物外,内共生细菌B8的代谢潜能仍有待发掘。

真的蜘蛛以及组织坏死会不会吓着大家,所以选了蜘蛛侠,表示漫威与DC都喜欢!(图片来自百度)

为了发现可能导致组织坏死的天然产物,作者比较了八种共生细菌(B1-8)的代谢谱,发现B8产生的根瘤菌素混合物滴度较低。意外的是,作者还发现了菌株B8独有的化合物家族(图1B),于是研究人员从菌株B8发酵液中分离出了主要成分(1-4)。活性分析发现所有化合物均有高度的细胞毒性,表明它们可能在真菌感染后促成坏死组织的形成。进一步研究发现细菌与真菌宿主共生时同样产生此类化合物(图1B)。至此研究人员解析并将这一系列新化合物命名为:necroximes A–D (1–4)图1C此处结果暗示了组织坏死是由共生细菌而非宿主真菌引发的。

Figure 1. ABurkholderia sp. strain B8 and Rhizopus microsporus monitored by fluorescence microscopy; staining with Calcofluor White and Syto9 Green. B) HPLC profiles of Burkholderia sp. in pure culture (B8) and in symbiosis with the host (F8); C) Structure elucidation of necroximes A–D (1–4).

细菌苯甲内酰胺类化合物具有杀真菌作用并能有效抑制肿瘤细胞的生长(图2B)。然而细菌苯甲内酯的生物合成至今未见报道。Necroximes是细菌苯甲内酯酰胺类家族的新成员,考虑到苯甲内酯酰胺的临床重要性以及此类化合物的高细胞毒性,实验仍要继续。

Figure 2. Benzolactone structures from diverse producer strains.


为了深入了解Necroximes生物合成的分子基础,作者对Burkholderia sp. 菌株B8使进行测序。经结构分析结合生信分析,作者锁定了一个66 kb的候选基因簇 nec (Gene accession number MN734804),该簇包含多模块trans -AT PKS/NRPS杂合装配线基因(necA–J),细胞色素P450单加氧酶(NecI)。研究人员构建了基因缺失突变体ΔnecA和ΔnecF(图3A),经HPLC分析发现:NecF负责合成苯并内酯酰胺,NecA负责肽侧链的形成,而M-13模块可能负责苯甲酸部分的形成,随后研究人员推测了Necroximes的生物合成途径图3B)。

Figure 3A) Organization of the nec biosynthetic gene cluster, strategy for gene deletion, and metabolic profiles of mutants. B) Model for necroxime biosynthesis on a PKS/NRPS assembly line.


基因簇含有许多非规范的DH域,作者进行了系统发育分析,发现了罕见的位于末端PKS(M-13)的DH结构域的基序与经典结构域不同(为PT样DH,图4A)。研究人员利用末端DH的氨基酸序列作为基因挖掘模板来筛选细菌基因组,发现了十个相关的PKS/NRPS基因簇。经实验证明:鱼类病原菌Pseudomonas baetica 中产生了oximidine III图4C)。基于细菌中生物合成机制的高度保守性,研究人员推测了化合物1、7、9、11的生物合成途径(图5)。



Figure 4. A) Phylogenetic analysis of DH domains and their conserved motifs (Weblogo), comparison of canonical (HXXXGXXXXP and DXXXQ) and non-canonical bacterial DH domains. C) Genomics-guided identification of oximidine III in P. baetica


Figure 5. Deduced PKS/NRPS assembly lines and predicted metabolite backbones that correspond to known benzolactones.


细菌苯甲内酯是一类具有抗肿瘤治疗潜力的天然产物,本文揭示了细菌苯甲内酯形成的分子基础,提供了其生物合成的第一个模型,提出了异常的肟形成和芳构化步骤,这为将来的生物工程和基因组挖掘方法奠定了基础。同时,本文证明PT样DH域可用于发现各种细菌属中的隐藏基因簇,这些簇可能编码各种已知的V-ATPase抑制剂。本文结果还挑战了以前从海绵,真菌等分离出的几种天然产物的生物遗传学起源,证实其实际上是由细菌内共生体生物合成的。


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本期参考文献:https://sci-hub.tw/10.1002/anie.201916007



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