要解决持续的抗生素危机，就需要发现具有新颖作用机制的化合物。本文利用生物合成基因簇结合缺乏已知自抗性基因的系统发育分析，预测发现了具有新的作用机制的糖肽类抗生素：Corbomycin和Complestatin，并通过定向进化发现了二者的作用靶标。本文研究显示，通过结合肽聚糖，Corbomycin和Complestatin能够抑制生长过程中细胞壁重塑所必需的肽聚糖水解酶(自溶素)，从而阻断细菌增殖。体外抗药性实验以及小鼠模型的皮肤MRSA感染中，Corbomycin和Complestatin均表现出良好的抗性水平，且耐药性水平较低，具有良好的应用前景。

3. 本文使用系统发育分析，将完整BGC中多个基因的信息而不是单个序列标签的信息整合在一起，跟踪完整GPA的BGC系统进化史；该策略还提供了有关非核糖体肽合酶中结构域的分组和位置的信息，以及纯化Corbomycin的重要结构预测；本文对缺乏已知自抗性基因的BGC进行系统发育分析的方法可推广到具有特定抗性机制的任何种类的抗生素；

4. 自溶素可以降解细菌细胞壁，也主要是指降解细菌细胞壁的肽聚糖。许多细菌都能产生自溶素，它参与细菌的繁殖、细胞分裂、隔膜的生成、鞭毛形成、遗传感受态及基因转移等重要生理活动。当细菌进行繁殖时，自溶素(LytA、LytB、LytC)通过水解亲代细菌的细胞壁中的肽聚糖，给子代细菌合成自身细胞壁提供原料，形成水解旧的肽聚糖而使新的肽聚糖得以延伸的模式，从而满足细菌能够继续生长繁殖的空间原料需求；当细胞进行分裂时，白溶素可以精准定位于分裂隔膜，并把此处的肽聚糖水解，从而让子代细胞彻底分开（谢兴凤, & 罗红. (2016). 肺炎链球菌自溶素与自溶相关性研究进展. 中国病原生物学杂志,  11(12), I0002-I0004.）。

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糖肽家族抗生素(glycopeptide antibiotis, GPAs)具有BGC多样性、高度后修饰和自抗性基因等特征，本文从课题组自有基因组序列和公共数据库中收集了71个GPAs的BGC，构建了基于这些BGCs的系统发育树，随后将自抗性基因纳入这些树中，作者发现含有常见自抗性基因（如抗生素的vanHAX 和vanY 基因，二者靶向脂质II的D-Ala-D-Ala）的BGC属于同一进化枝（图1a），但其他有明显共同祖先的BGC却在其他分支上，这些进化史上不同的进化枝缺乏任何已知的GPA自抗性基因，这暗示它们可能具有不同的生物学活性。这些分歧进化枝中的一个包含已知化合物complestatin（图1b），随后研究人员从土壤Streptomyces sp. WAC01325中纯化了complestatin。但第二个分歧进化枝的BGC没有明显特征，于是作者使用系统发育树进行结构预测，并指导从Streptomyces sp. WAC01529中纯化得到代谢产物corbomycin。

Fig. 1 | Phylogeny-guided discovery of complestatin and corbomycin.

Corbomycin和complestatin主要表现出对革兰氏阳性细菌的活性(包括MRSA)，最小抑菌浓度（MIC）为0.5至4 μg/mL，与万古霉素相当。作者通过靶标过表达、敲除和外源脂肪酸回补等试验，发现complestati和corbomycin不是靶向S. aureus or Bacillus subtilis 的脂肪酸合成。鉴于糖肽类抗生素对细胞壁有活性，研究人员测试了Corbomycin和complestatin对肽聚糖代谢的影响，发现在Corbomycin和complestatin作用下，肽聚糖代谢在转糖基化下游受到影响，但对肽聚糖合成没有明显影响。尽管所有阻断肽聚糖合成的抗生素都会通过肽聚糖合成与降解之间的不平衡促使细胞裂解，但complestatin和Corbomycin与各种细胞壁和膜活性抗生素都没有协同作用，但彼此具有叠加作用。因此，Corbomycin和Complestatin可能通过类似的机制靶向肽聚糖代谢，但该机制与以前报道的任何抗生素均不同。

Fig. 2 | Corbomycin and complestatin affect peptidoglycan metabolism. Microscopy of B. subtilis grown in 0.6 × MIC corbomycin or complestatin. 自溶素是一种正常肽聚糖代谢必不可少的多样化肽聚糖降解酶，它能够将新物质插入现有的细胞壁中，并在分裂间隔处裂解肽聚糖实现细胞增殖。透射电镜（TEM）显示B. subtilis 细胞中隔结构异常，鞭毛缺失，细胞壁“蓬松”和增厚以及细胞质变形。这种独特的表型不同于几种对照抗生素，但与自溶素缺陷的B. subtilis 相匹配。

研究人员以corbomycin和complestatin为选择压力，对B. subtilis 168 和S. aureus ATCC 29213 进行自抗性突变体的定向进化。获得了B. subtilis 在亚MIC水平的耐药性突变株（图3a）。随后作者全基因组测序鉴定了B. subtilis  抗性突变体的蛋白质编码区中的突变（图3b）。研究人员进行突变基因的单个敲除表征，但它们仅使对Corbomycin和Complestatin的敏感性降低两倍左右，表明Corbomycin和Complestatin可能具有多蛋白靶标。基于耐药突变和表型证据，作者认为Corbomycin和complestatin会阻断自溶素的功能。

自溶素会使肽聚糖降解并导致细胞壁裂解，作者使用叠氮化钠处理细胞，使得B. subtilis 细胞膜旁pH值升高，自溶素活性增强导致细胞壁裂解。随后发现：Corbomycin和complestatin可以保护细胞壁免受叠氮化钠诱导的裂解，而氯霉素则不能（图3c）。对于通过抑制肽聚糖合成引起的金黄色葡萄球菌的裂解，观察到了相似的结果。这表明Corbomycin和complestatin抑制全细胞中自溶素的活性。接下来，研究人员纯化并测试发现Corbomycin和Complestatin对两种B. subtilis 内肽酶-CwlK（YcdD）和CwlO（YcvE）都有抑制作用（因为它们在营养B. subtilis 生长过程中均具有活性，作者选择这些酶代表生理相关的自溶素，二者靶向不同的键并具有不相关的催化结构域，图3d+3e）。说明Corbomycin和Complestatin具有广泛的肽聚糖水解酶抑制活性，且与酶种类无关。

Corbomycin和Complestatin抑制各种结构不相关的自溶素，表明抑制来自抗生素与肽聚糖之间(而不是抗生素与酶之间)的相互作用。作者通过将抗生素与不溶性肽聚糖孵育，并用HPLC定量剩余的可溶性抗生素。结果发现 B. subtilis and S. aureus 肽聚糖以剂量依赖的方式与Corbomycin和complestatin结合并从溶液中去除（图4a）。为了进一步可视化肽聚糖的结合，研究人员合成了具有荧光标记并保留靶向活性的corbomycin-BODIPY和complestatin-BODIPY的加合物，染色后发现二者确实与肽聚糖结合（图4b，c）。

目前，complestatin和corbomycin是第一个抑制肽聚糖重塑的化合物，该家族的不同成员可能具有稍微不同的肽聚糖结合位点，这可能解释了Corbomycin和Complestatin之间活性的细微差异。Corbomycin和Complestatin对多药耐药的临床分离株具有活性，显示出低耐药性，并且对皮肤感染MRSA的小鼠模型有效，这对药物开发是一个值得开心的事情！