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遇见/摘要
背景1:Biotin属于B族维生素,又称维生素H,维生素B7等。
背景2:“suicide enzyme”也称“single turnover enzyme”,是指在酶作为共同底物参与反应,并且在反应结束后失去催化活性。目前发现的suicide enzyme有三个:1 本文中报道的来自蓝细菌BioU,参与biothin合成;2 Saccharomyces cerevisiae来源的THI4p,参与另一个B族维生素Thiamine pyrophosphate 1中噻唑基团的合成(Nature. 2011,478(7370):542-6. doi:10.1038/nature10503);3 大肠杆菌来源的Ada ,参与DNA修复(Cell,1986, 45, 315–324. J. Biol. Chem. 1988,263, 4430–4433. Proc.Natl Acad. Sci. USA ,1985,82, 2688–2692)。
遇见/内容
通常情况下,Biotin 的生合成途径在所有生物中都是相似的,即:1. 庚二酰辅酶A或者庚二酰ACP的合成;2. 庚二酰中间体在BioF,BioA,BioD和BioB四个酶的作用下合成biotin。
本文作者在研究biotin生合成基因簇时发现Synechocystissp. PCC 6803 和 Cyanothecesp. PCC 7424基因组中缺少了bioA,并且bioF,bioD 以及bioB 并不像其他微生物的基因簇都是成簇存在,而是都分散在基因组中。通过生物信息分析,在这两株菌中分别发现了可能代替bioA 作用的基因,slr0355(bioU) 和PCC7424_0836。通过基因敲除以及基因回填实验确定了这两个基因确实能够参与biotin的生合成,可能与AON(3,8-amino-7-oxononanoate)向DAN(4,7,8-diaminononanoate)的转化有关(Figure 1.)。
Figure 1. a Synechocystis sp. PCC 6803-Δslr0355::Kmr growth on a BG-11 plate b and on a BG-11plate supplemented with 1μM biotin .
3到4的转变需要NADH和氨基供体,但是作者在体外反应时,BioU确实使 3减少,但是反应不需要任何氨基供体,而且检测不到4。作者猜测BioU作为氨基供体参与了反应,从而生成的化合物与酶形成了结合物,因此检测不到4。采用LC-HR-MS分析体外反应体系,以及天冬氨酸N端酶水解后的反应体系,发现在反应后的121-137位中间氨基酸片段比反应前的分子离子峰多了171。对124位赖氨酸进行突变,反应不能进行,从而确定DAN与124位赖氨酸结合(Figure 2)。
在已知的biotin合成途径中,DAN从络合物中释放,进而作为BioD的底物,产生6。在BioU与3的反应体系中,没有检测到4。作者发现,EcBioD(大肠杆菌来源BioD)能够在NADP+存在的情况下催化BioU-DAN产生6。但是在反应过程中依然不能检测到4的存在。BioD催化4产生6需要两步反应。通过以上实验结果作者猜想,BioU-DAN结合物被羧酸化产生BioU-DAN氨基甲酸的结合物,之后DAN氨基甲酸被释放,进而作为BioD的底物参与反应(Figure 3a)。在反应过程中4以BioU-DAN的形式存在,因为不能检测到4。将BioU在ΔbioD 的大肠杆菌中表达,不能得到6。这是因为BioU只能产生5,只有部分BioD的作用。但是5不稳定,因此不能检测到(Figure 3b)。BioU和EcBioD能够产生6,但是在这个反应过程中,不需要氨基供体的参与。这与已知的反应有悖。作者猜想,BioU在反应中作为氨基供体,Lys124中的氨基在反应中转移到5上。为了验证假设,将反应前后的BioU用天冬氨酸激酶进行降解之后,MS和MS/MS分析第121-137(121DALKRTSAVEQLITLRE137)氨基酸片段。实验结果证明,Lys124在反应后转变为半缩醛(Figure 3c)。而且发现反应结束后,BioU失去催化活性。
Fig. 3 | Proposedreaction of BioU via the BioU-DAN conjugate. a, Reactions of BioA andBioD in typical biotin biosynthesis. b, Proposed reactions of BioU andBioD in biotin biosynthesis in Synechocystis sp. PCC 6803. BioU-SA indicates BioU-Lys124 semialdehyde. c, LC-HR-MS analysis of the target peptide of BioU by Asp-Ndigestion before and after the reaction.
为了进一步证明BioU的反应机制,作者得到了BioU的蛋白晶体。分析发现BioU具有两个domain(Figure 4a)。Domain I是核酸结合区域,domain II是底物结合区域。通过定点突变后的蛋白晶体确认,3与Lys124连接(Figure 4b)。BioU中保守序列15GFGGLG9中Arg189-Ala190以及Thr191侧链的氮原子能够识别NADP+的磷酸基团(4c)。在3与BioU形成络合物的过程中脱去的一分子水与His198的氮端和Lys124的碳端结合(4b)。BioU-DAN的络合物共晶也揭示了Lys124与NAD+的结合方式(4d)。通过BioU与7的共晶发现,9位羰基与His233的氮端结合,His233的氮端与Asp235结合。从而确定,His233和Asp235是BioU催化BioU-DAN中7位羧酸化的活性位点(4e)。作者将BioU中His233和Asp235进行突变,与EcBio反应,发现6的产量减少,而非完全消失。而且突变后的酶仍然能够形成BioU-DAN络合物。以上实验结果说明His233和Asp235与络合物的生成无关,是羧酸化的反应位点。羧酸化后DAN通过NAD(P)+氧化从BioU中释放。至此,本文完全确定BioU能够参与biotin合成中的三步反应以及其反应位点以及机制(Figure 5)。
Fig. 5 | Proposed reaction mechanism of BioU.
作者在研究biotin生合成基因簇时发现Synechocystis sp. PCC 6803在基因组中少了BioA的情况下仍然能够产生biotin。研究人员通过生物信息分析及一系列实验,最终确定了BioU的功能:先形成BioU-DAN络合物,再生成DAN氨基甲酸,以及释放DAN氨基甲酸。BioU在反应结束后失活,符合“suicide enzyme”特征。这是目前发现的第三个suicide enzyme。
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