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原代建系更新参考 组织-细胞痛点

已有 364 次阅读 2024-4-27 01:53 |系统分类:科研笔记

原代建系更新参考 组织-细胞要点

1:离体处理,建议手术刀并排两三个固定后,冰上最快速度处理,建议十分钟内入皿。

2:不管哪种培养体系,都要有一组含血清,这个每个实验室都很熟悉,上清前几代留着,后面建系中,细胞受损后救助(冻存复苏,长期培养驯化过程中细胞状态差等救助),类器官,无血清方案两年统计结果给出含血清参考。含血清优势是可行,每个实验室都熟悉相关足够的经验与问题解决,还可先成功,大量细胞拿到,有充足的细胞后,在评测无血清。

3:冻存复苏:建议两指厚面包裹后直接负80后,第二天液氮,有泡沫冻存盒裹在棉花外面效果更好,建议平时冻存复苏评测。较挑剔的有免疫细胞,原代等测试效果比较好,无血清方案,建议新式冻存方法评测比较。

4:建系病毒要点:高滴度。

5:技巧参考:要对细胞镜下形状熟悉(或者先筛选目的细胞有个大概判断后),可不用分离液,流式等前期筛选,单克隆多做些,等大量培养后在做相关检测,避免分离液化学损伤,流式机械损伤而使细胞建系培养不顺利问题。大大提升成功率,上述1-3是组织到细胞,4是难感染细胞痛点,要能理解上述要点,重复实验容易并可行,也是建系简单重复关键。

组织-细胞    细胞-组织   难养细胞系参考统计,上皮,SV40 (原代要熟悉培养特性,正好与难养系长满传代时间一致。)缺氧培养应用优势整理中,缺氧培养优势是成干后,细胞分化控制目的(相关文献建议看成干后动物模型验证)

6:传代培养注意:千万别按细胞系传代习惯,总是拿出来开看细胞(这点尤为重要,关乎成败)建议多放50%完全培养基后,4-7天传代合适,成纤维,内皮,上皮首代消化费劲,建议考虑组织-细胞处理步骤影响的组织活性,例如操作步骤全程冰上,快,(消化液选择不合适,时间过长等因素),树突,kuffer,难消化建系工业用途可来信告知,这类我们可试完成建系难点痛点建系(我们拿技术换口饭吃)

 

SV40建系培养特点,细工技术储备充足(国内建系做技术储备),如您建系也用SV40,如遇到问题,可讨论。问题结合统计有些共性,也有组织特性,可讨论。

人肾皮质近曲小管上皮细胞;HK-2    人乳腺上皮细胞;MCF-10A     人肺正常上皮细胞BEAS-2B     人肝癌细胞;Hep G2 [HepG2] 上皮样      人胚肾细胞;293 [HEK-293] 上皮样   人脑星形胶质母细胞瘤;U-87 MG [U87MG;U87 MG] 上皮样

后期相关问题统计

维持培养:维持培养验证建系,种子库等重要实验试剂筛选推荐,细工内部应用维持培养,在高产蛋白,培养基血清试剂评测种子库,生产应用做技术评测,外泌体应用,噬斑工业应用都取得了不错的效果。

控制分化:缺氧,成干,维持培养应用后续在统计讨论

离体后开关通路(细工优化胰酶解决这个问题,胰酶经过各种胰酶敏感细胞系长期统计筛选,胰岛胰腺类细胞系),也是离体后首代培养关乎成活关键。

细胞痛点讨论及参考-系验证可行性,原代应用有理由

问题关于黑点

细工建议参考,用对试剂耗材(种子库级别细胞不建议用便宜试剂,保种上百只种子细胞,也用不了多少钱的)胰酶轻柔处理(避免枪直接吹打细胞损伤也是较重要指标参数),几代或十几代后,黑点会全部消失。这个建议也只是救助办法参考建议,经历过黑点的细胞,建议重新保种国内正规库来源细胞。

问题细胞系生长慢-原代生长慢-细胞养几代后就爬爬这种情况

细工建议参考 给出方案是进口瓶培养(康宁,nunc,德国产细工全部现货) ,种子库级别试剂(三千以上胎牛,我司验证五年以上南美)我司培养基或者是GIBCO培养基,放足培养基(多些也没关系)几天不动,看下恢复情况,结合我司胰酶(无损消化)传几代应该能找回较好状态,该方法也适合细胞养几代后就爬爬这种情况(上述方法也适合细胞养传代后细胞就爬爬这种情况,该因素原因很多,具体情况集体分析)该方法也建议原代首代培养(类器官)就是普通培养基加胎牛(因子贵,lag phase长、无血清不稳点)全部能替代,细胞够多或稳定后在上无血清可做参考。类器官配套耗材U型低(不加辅助条件成球)及磁珠配套磁力成球可来信告知索取资料及技术讨论。

成瘤不稳定组参考,细胞培养分化控制

瓶,慢养慢传代慢生长,无损胰酶,少二氧化碳,减缓生长,减缓分化,理由:来自成干成球培养,难养细胞株痛点统计规律相似特点。分出一批评测,操作更简单,给成瘤不稳定组,提供一组备份条件,从成干特点上看(缺氧培养减缓细胞分化-这个特点又能起到明显作用后,我们可能考虑离体后巨噬培养看看能否控制细胞分化,后面给生产型用户做些技术储备),优势挺大的,也给出一套备份技术储备。该方法只来自细胞救助案例,救助结果还比较理想,成瘤率逐步偏低是很多实验室遇到的问题,也是了解培养习惯统计后,提出该方案,如验证有效拓展应用,可考虑以下优化应用,北医白凡老师,生物物理所-李翀老师,10-1000个细胞成瘤五六年前文献可查下,完成上述验证,一瓶25培养瓶可接种几只动物,从成本上可大大降低培养中血清成本,并在采购血清,基质胶等上用到最好级别试剂并大大减少细胞培养成本。(北京实验室需合作验证可来信告知或讨论细节痛点,例如4-7天长满后,处理容易成团成片,传统处理方法就会影响细胞活性,胰酶相关问题统计了有五六年,对胰酶敏感的系或原代,都有不错的表现,SV40建系都容易成团成片。下一篇详细介绍各类成团成片特点,并在冻存复苏验证,转染应用都会有明显效果。

成干验证,减血清,增长速度很有参考意义。更多分化延展。

当单一的畸胎癌细胞种植到胚胎上时可以长成良性组织(Kleinsmith and Pierce,1964),这提示在转化的细胞中表型改变是可逆的。

以至诱导分化经常被推荐作为肿瘤治疗的模型(SpremulliandDexter, 1984;Freshney,1985;Marks and Breslow,2007;Piccirillo et al.,2006; Wang et al.2008:Kangetal,2014)。



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