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土壤线虫分类鉴定的困难与挑战 精选

已有 4251 次阅读 2022-8-6 23:22 |系统分类:观点评述

回国工作即将满三年了,一直在计划对这段时间的工作做个小结。从博士毕业时懵懂无知,沉浸在线虫分类中怡然自得,到回国就业的艰辛无奈,再到为了适应国内形势,转行开始做生物信息与土壤线虫生态,一路下来一直在思考我们线虫分类学科该如何发展,未来在哪里?借学校暑假休息的空隙,简单整理了下自己的思考,只言片语可能还不完善,后续再做补充完善和系统化的整理。


线虫分类鉴定之困,首先困在缺乏分类学相关人才


2011年我大学毕业,很荣幸获得了比利时政府奖学金资助赴Ghent University攻读硕士学位,开始与线虫结缘。2013年硕士毕业,在面临研究方向的选择时误打误撞与植物寄生线虫分类相关的课题。彼时还不明白这一选择意味着什么。国外的生活平静而简单,专心从事一个研究方向是充实而幸福的。每一个小的进步、小的发现也能带来满足和快乐。2017年博士毕业答辩上,导师开玩笑说我是全球40岁以下青年人中最懂线虫分类的三个人之一。当时觉得是吹捧过度,后来才懂得这句话更多的是无奈,因为全球现在专注于线虫分类的年轻人本身可能也没有几个人。一般来说,物以稀为贵,但我好像没碰到这样的好事。由于线虫分类背景,纵使我博士期间已经以一作发表8篇SCI论文,且基本都发在业内最好刊物上,也很难找到对口博后机会。而回国找工作就更为困难了。国内的高校和科研单位多以论文影响因子来作为主要评判标准。以这样的标准来招聘,基本算是给分类背景的研究人员判了死刑。后来经过一番努力在以色列找到了博后职位,但研究方向更偏应用,依然没机会发表高分论文。期间为了就业和生存,开始自学计算机和生物信息学相关知识。最终总算找到感觉,在2019年发表一篇Bioinformatics和MER,同时在南农线虫团队的支持下顺利入职南农植保院。我的经历应该不是个例,相信所有分类人都有这样的体会。这种制度的最终结果是分类专业人才极具下降,直至完全消失。相比昆虫、植物等类群,线虫分类专业人员基数本身就少,这样一番操作下来,线虫分类专业人才所剩无几也是完全在情理之中了。

选择分类有时感觉很后悔,也很委屈,但最绝望的地方可能也是希望。传统的形态分类学科确实落后了,大多还处在描述阶段。一个只停留在描述的学科严格意义上不能称之为科学。以我看分类不是没希望,而是很有希望,只是需要有所转型,这也是我一直没有放弃分类,还在努力探索的原因。当然,这些都是后话。

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2017年10月11日在比利时根特大学最古老的礼堂Het Pand完成博士答辩。站立者左1为导师Wim Bert,左2为答辩委员会主任Etienne Geraert (根特大学理学院原院长,当年78岁),左3为Tom Moeans (海洋线虫专家),Matthew Back (英国 Harper Adams University),Mieke Verbeken (菌物专家),Olivier De Clerck (藻类专家)。

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2015年在英国林奈学会介绍自己开发的线虫3D打印技术

线虫分类鉴定之困,在于线虫太小,特征少


加州大学河滨分校著名线虫学家Paul De Ley曾经讲过,如果线虫像哺乳动物这么大,那么线虫分类将是一件非常简单的事。这其实说出了线虫鉴定难的一个关键因素。土壤线虫大多在2毫米以下,肉眼不可见,对于初学者甚至难以区分水中的纤维和线虫,鉴定更是极难的。相比昆虫丰富且识别度高的形态,绝大多数土壤线虫都呈现线状,总体体态非常相似,这更增加了识别的难度。在日常操作中,解剖镜下甚至难以进行目级别的鉴定,这种困难在宏观生物中是难以想象的。


在做分类的过程中结识了不少做土壤生态的朋友,我很惊讶于土壤线虫生态相关研究中涉及的大量线虫鉴定内容。有次问他们,这里面的线虫都是怎么鉴定的?后来发现,国外的朋友常用Tom Bongers的那本图册,国内常用尹文英院士编著的中国土壤动物检索图鉴。鉴定的过程基本就是对着图鉴看哪个相似,感觉像就取其名。这两本书收录的种类相比已知土壤线虫种类要少很多,但事实是全球土壤生态学研究中报道的线虫基本都是这些收录的类群,其中原因不言而喻。如一看到大口针短尾的矛线,基本都扔进Eudorylaimus,但殊不知,与其相似的最少有10个属。一看到小口针、细尾的垫刃线虫,就放在Filenchus里面,殊不知,垫刃科有超过30个属,差不多都具有这样特征。错误的类群鉴定,带来的是严重的生态指标的错误评估。比如垫刃科,Filenchus是食真菌的,而Cephalenchus是能够寄生植物的。

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我2017年发表在Organisms, Diversity & Evolution的论文,以垫刃科为例,不同属间特征非常微小且难以描述,如果没有观察过大量标本,仅凭资料中的墨线图很难完成鉴定。


线虫分类鉴定之困,在于线虫种类太多


较为乐观的观点认为地球上线虫种类超过100万种,保守估计至少也有10万种以上。考虑到近年来通过分子生物学手段发现的大量隐种,现在真实种类至少有50万种。 目前已描述的土壤线虫超过4000种,实际数字应在十倍以上。这些土壤线虫分属于7或8个目,超过300个属。实践中,森林土壤每100 g土壤中常有超过1000条线虫,属于至少20个以上的种。硕士期间参与的一项菲律宾热带雨林土壤线虫研究中,我们发现部分地点单个土壤样品中存在100个以上的种。如此高密度、多种类的分布,应该在动物中是绝无仅有的存在。此外,混种现象更加剧了鉴定的困难。一般来说,同一个土壤中的同一属线虫往往只存在一个种。但近年来在分子条形码的协助下,我们发现同一个属常出现混合发生的现象。这一现象在植物寄生线虫上研究较多,比如多种根结线虫混合发生,但在自由生活线虫中关注相对较少。试想,同一个样品中存在几十种形态相似,且只有几百微米的线虫,完成鉴定能不难吗?


线虫分类鉴定之困,在于文献资料零散,可用信息太少


传统线虫学研究主要有两大阵营,美国比较集中,主要是Cobb及其徒子徒孙。欧洲比较零散,我之前所在的比利时根特大学,荷兰瓦赫宁根,匈牙利的Eötvös Loránd大学以及英国寄生虫研究所都是欧洲的线虫学研究发源地。这样的历史原因就造成了一个很大的问题,即后发国家获取文献资料和线虫标本极为困难。线虫形态分类相关文献大多数是早于电子文档时代的,尤其是书籍,几乎是没有电子版的。近年来的文献虽可在网上查询,但其引用的文献又常是早期发表的,因而到具体的鉴定时又难以绕过早期文献。此外,线虫相关文献比较分散。虽有Siddiqi的Tylenchida,Wasim & Shamim的Mononchida, Dorylaimida等综合性的分类参考书,但这些书信息已相当滞后,且缺乏种级别的鉴定信息。目前我们在做的生态学项目,很多时候一个土壤样品的鉴定需要同时参考3-5本专著以及十多篇论文,才能完成一个较为准确的鉴定。我回国前购买或复印了一些书籍,同时会经常麻烦导师或以前朋友帮忙复印相关资料。借助这些信息和支持,目前我们尚能较为顺利的开展一些分类工作,但相信对于大多数课题组来说,获得大量参考资料仍然是困难的。


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August Coomans教授退休时低价出售线虫分类学原版书籍,这三本总共花费30欧。这些书籍现在均已绝版,市面上无法买到。

除文献外,最困难的是缺乏标本供初学者查看。目前很多从事线虫学鉴定的初学者大多都是自己翻书查找资料,然后对照照片或者墨线图。线虫是个立体的生物,分类特征分散在不同层面,还有很多复杂的感官体验,都是几张图片无法代替的。因此,学习识别线虫最好的办法是去看这个属或者种的标本实物。当年学习线虫鉴定的时候,教授一般会一对一带着我们用数码显微镜观察标本,一个一个特征的现场讲解。此外,学校的标本馆里面保存了几乎所有土壤线虫所在属的标本,遇到不清楚的属时可随时借用模式标本进行查看比较。相比国外,我国线虫研究起步晚,从事相关工作的专家少,几乎没有太多土壤线虫标本共大家学习和借鉴。


线虫分类鉴定之困,在于分子数据太少,且不可靠


许多刚接触线虫分类的朋友经常问我,线虫鉴定应该不是问题了吧?用细菌、真菌的套路做个扩增子测序,按照97%或99%进行OTU聚类,然后直接把所有的类群一次性给注释了不就好了?或者我就检测单条虫,跑个COI、18S、ITS这些靶标基因,然后BLAST找最近的?这个问题我后面还会单独写一篇介绍,但总之一句话简述:这些方法在线虫上不靠谱。原因主要是引物和数据库的问题。首先是引物,线虫种类太多,很难找到一个能扩增所有类群的通用引物,现有的引物多存在较为明显的偏好性。第二个问题,也是最关键的问题是数据库里面的线虫信息太少。目前大概只有20%已报道种有分子序列,而仅有的序列里面其实有很多是错误的。也就是说你放进去一个种进行BLAST,大概率结果是错的。这个现象在矛线目线虫中尤为明显,只有不到10%的种有序列,因此结果基本是不可信的。


第一个偏好问题其实相对好解决。我们现在测试的线虫宏基因组、宏线粒体基因组等技术基本上可以解决引物的问题。但第二个问题数据库问题就困难多了。原因又回到第一个话题上了,即懂分类的人太少了。每个人的研究都需要分类学家,然而分类学家的工作可以在NCBI里面轻易获得,甚至论文中也不会引用这些工作。同时,分类学家难以获得经费支持和工作机会。这种情况下,又有谁愿意继续这样的工作呢?我预测数据库的缺陷短期内无法解决,也就是完全分子鉴定可能还将在未来很长一段时间无法广泛应用在线虫群落的研究中。


线虫的分类学未来在于引入分子生物学,生物信息学


说了这么多问题,该回到主要解决方案上。这么多年一直在坚持做土壤线虫分类鉴定,处了难以割舍感情外,更重要的是我认为这块还是有很多工作可以做的。传统的分类框架性工作已经完成,未来线虫分类工作可能有“小”和“大”两个突破口,一是功能基因研究,即从形态描述的“是什么”,走向形态差异机理研究的“为什么”。这方面的研究已经在模式线虫中有了初步的进展,如平和锉齿线虫的形态可塑性相关基因研究,但目前尚未拓展到其他类群中。 二是结合生物信息学走向大数据时代。比如采用组学和生信技术对区域或全球范围内的土壤线虫进行定性定量研究,用来解析生态学问题。如Dorota Porazinska团队所做的宏条形码研究,或Thomas Ward Crowther课题组2019在Science上发表的全球土壤线虫群里研究的论文。当前限制这个研究方向发展的主要因素是生物信息技术门槛比较高,同时在这一方向仍然有很多技术问题尚未解决。这些问题也是我入职后一直在着重关注的。目前做了一些工作,如利用人工智能进行线虫图像识别 (NemaRec软件)、建立自己的数据库(PPNID软件)、以及开发土壤线虫大规模鉴定的组学技术。虽然距离完全解决问题还有距离,但希望通过持续的投入更好的服务于土壤线虫群落和生态研究。


结语

土壤线虫分类任重道远。技术上的难题相信最终都会逐个攻破,但线虫分类学家的流失和学科的没落可能还需从制度上进行改革。同时,线虫分类工作者也需要与时共进,积极学习和使用新的方法技术,从更“大”和更“小”两个层面将传统学科从推向新的高度。




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