2，所谓常见的细胞因子，表面的或是胞内的，处理起来有什么不同。为什么表面的用无血清培养基，胞内的要用到PBS，最后换回无血清培养基？胞内染色要加上非特异性抗体FC抗体？处理时间是多久合适？一种细胞可分装来分别检测，不同时染上多种抗体？抗体的实验建议值是多少，实验中又是怎么做的？

    真是给我自己出了难题，今天周末，一点都不想动，可还是得把这些问题查出来。

  其实也没有怎么查，按照实验室小boss讲到的，加上自己的理解，感觉不到的以后再自我纠正。

  表面上的分子较好处理，通过MTT法计数得到细胞数量。

   先留个问好在这里，因为protocol上写到要玻璃棉除掉B细胞，得到T细胞。在操作时，没有看到有这一步，之后也没来得及问一下。而且后面有一个CD19算是B细胞的marker，这需要不一样的处理。

  表面染色的是取10的6次方的细胞，离心收集，之后悬在20ul的无血清培养基中。胞内的是先取出10的7次方个细胞，离心收集，后用PBS洗上两遍，再加上多聚甲醛固定，PBS洗后再加皂素破膜，PBS洗上两遍。加上无血清培养基，20ul分装，因为检测多种胞内因子。

 

  胞内的用到了PBS，只是在洗细胞，好再加别的试剂反应。之后要加抗体的时候，还是用培养基悬浮。表面分子不需要那么复杂处理，也用不着洗，于是不用PBS。用培养基不用PBS，主要是因为是活细胞吧。提供一个环境，让细胞活着。至于不加血清，可以考虑到这里不用它的功能。在养细胞时，胎牛血清是必须的，因为引导细胞分裂。这里不需要。

   胎牛血清作用待后续~~

  不只有胞内因子需要加上FC抗体，表面的也要。因为表面也要非特异性的封闭。（这一点待后续求证）

  表面分子染色后，要洗掉抗体。（用什么洗，PBS or  培养基？）

  表面很快，胞内过夜。这是见到的操作。

  不能同时被染上多种，有解释说是我们有的抗体颜色只有这么几种，荧光发出同一种颜色会无法检测。 好像也有人做过，染上多种颜色，待求证和分析。

  说是1ul/20ul样品，能染上80~90%的细胞。试验中本着节约的原则，会根据细胞数量经验值，适量少加一些。

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